Deutsch

Der zelluläre Schleimpilz Dictyostelium discoideum zeigt in Bezug auf posttranslationale Modifikationen viele Parallelen zu höherentwickelten Organismen. Aufgrund dieser Tatsache und wegen seiner einfachen Kultivierung wurde dieser Eukaryont herangezogen um die funktionelle Bedeutung von Glycanstrukturen an Proteinen zu untersuchen. Mutanten mit einem reduzierten Fucosylierungsgrad zeigen phänotypische Veränderungen in der Lebensfähigkeit ihrer Sporen und präsentieren im Vergleich zum Wildtyp veränderte glycanabhängige Epitope an deren Proteinen. Bislang fehlte eine detaillierte Charakterisierung der vorhandenen Glycanstrukturen in Wildtyp und Mutanten. Diese ist jedoch erforderlich, um den verursachten Phänotyp auf molekularer Ebene erklären zu können. Anhand des prominenten Sporenmantelproteins SP96 wurde in der vorliegenden Arbeit eine eindeutige strukturelle Aufklärung der in den verschiedenen Mutanten vorliegenden posttranslationalen Modifikationen erreicht. Am Protein des Wildtyps konnten etwa 20 an Serine gebundene Fucose-Einheiten, sowie etwa 60 Einheiten der neuartigen, phosphodiester gebundenen Disaccharidstruktur (Fuc(α1-3)GlcNAc-α-1-P) an Serine nachgewiesen werden. Diese wurde mittels GC-MS und LC-MS Analysen, sowie durch 1D- und 2D-NMR-Spektroskopie eindeutig identifiziert. Die Quantifizierung der posttranslationalen Modifikationen am SP96 Protein erfolgte mittels HPAEC-PAD Monosaccharid- und GC-MS Analyse sowie eines colorimetrischen Phosphattests und zeigte, daß im Protein des Wildtyps über 70% der Serine glykosyliert vorliegen. Die Abnahme der Fucose in den zwei Mutanten auf etwa 20 % bzw. < 5% im Vergleich zum Wildtyp konnte in einer Mutante eindeutig dem Verlust der terminalen Fucose von der Disaccharideinheit, in einer anderen Mutante dem weiteren Verlust der O-glycosydisch gebundenen Fucose zugeordnet werden. Die Lokalisierung der vorhandenen Glycanstrukturen erfolgte nach enzymatischer Spaltung des Proteins und anschließender Edman-Sequenzierung der mittels Antikörper markierbaren Fragmente. Darüberhinaus wurde ein bereits in D. discoideum etabliertes Expressionssystem, benutzt um Peptidmotive aus SP96 auf ihre potentielle Glykosylierbarkeit hin zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, daß alle Modifikationen an der Aminosäure Serin vorliegen, wobei der überwiegende Teil am C-terminus des Proteins lokalisiert zu sein scheint. Die identifizierten, quantifizierten und lokalisierten Glycanstrukturen konnten abschließend in direkten Zusammenhang zu den Epitopen monoklonaler Antikörper gebracht werden. Die phänotypischen Beobachtungen lassen sich so erklären, daß der Verlust der direkt an Serin gebundenen Fucose, im Gegensatz zu der terminal am Disaccharid gebundenen, einen größeren Einfluß auf die korrekte Eingliederung von SP96 in den Komplexvon Sporenmantelprotein hat. Dies führt letztendlich zu einem permeableren Sporenmantel.

English

In relation to post-translational modifications the cellular slime mold Dictyostelium discoideum has many features in common with higher eukaryotic cells. Therefore this easy-to-handle eukaryotic organism was chosen to study the relationship of glycosylation patterns on proteins to their function. Mutants with a lack in fucosylation have a phenotype of less viable spores and present different glycan dependant epitopes on proteins. Until now no detailed study has been done to characterise the different oligosaccharide structures in order to elucidate the relationship of the glycan to function and to relate the glycan structures to the antibody epitopes. In this thesis the exact differences in the post-translational modifications of wild-type and mutants of D. discoideum were analysed on the purified major spore coat protein SP96. The wild-type protein contains approximately 20 serine linked fucose residues and approximately 60 sites with a newly identified, O-linked phosphodiester-linked disaccharide structure (Fuc(α1-3)GlcNAc-α-1-P) attached to serine. This new structure was identified by GC-MS and LC-MS analysis as well as by 1D and 2D-NMR spectroscopy. It could be shown that the decreased amount of fucose in one mutant to 20% of the wild-type content was the result of a missing terminal fucose on the newly identified disaccharide structure. Another mutant, with a further decreased amount of fucose (less than 5% of the wild-type content) lost furthermore the O-linked fucose residues. The identified glycan structures were correlated with the epitopes of some monoclonal antibodies. This allowed some conclusions as to the mutations in the different mutants to be drawn. The quantification of post-translational modifications of the SP96 protein was determine by HPAEC-PAD monosaccharide and GC-MS analysis as well as by a colourimetric phosphate assay. This showed that more than 70% of the serines in wild-type SP96 were glycosylated. The localisation of modifications on SP96 was also partially achieved. To localise some of the glycan structures on SP96 it was enzymatically digested, and peptide fragments detected by monoclonal antibodies were used for Edman sequencing. A second approach used an already established D. discoideum expression system to analyse recombinant peptide motifs of SP96 for their O-glycosylation. It was shown that serine was the only modified hydroxyamino acid and that the main location of the glycosylation was the serine-rich C-terminus of the protein. It can be concluded that O-linked fucose has a higher influence on the correct integration of SP96 in the spore coat than the terminal fucose of the disaccharide. This finally leads to the increased permeability of the spore.