Deutsch

Aminoglycosidantibiotika (AGAs) stellen therapeutisch wichtige Substanzen dar. Um vorhandene Resistenzmechanismen zu umgehen und Nebenwirkungen zu minimieren, sind gezielte Modifizierungen an den Molekülen notwendig. Eine effiziente Möglichkeit stellt die Biokombinatorik dar. Dafür ist ein detailliertes Verständnis der Biosynthesen der Aminoglycoside notwendig. Ziel dieser Arbeit war die funktionelle Charakterisierung der Glycosyltransferasen NeoM, NeoF, KanM1 und KanM2 sowie der Deacetylasen NeoD und KanN aus dem Neomycin- und Kanamycinbiosyntheseweg der Produzentenstämme Streptomyces (S.) fradiae und S. kanamyceticus. Erste Versuche zur biokombinatorischen Modifizierung dieser AGAs wurden durchgeführt. # Die homologen Enzyme NeoM und KanM1 konnten als 2-DOS : UDP-GlcNAc Glycosyltransferasen (N-Acetylparomaminsynthasen) identifiziert werden. Nach Optimierung der Expressionsbedingungen wurden in vitro Enzymtests durchgeführt, wobei die heterolog überproduzierten Proteine eine hohe Donorsubstratspezifität zeigten, TDP-Glc oder UDP-Glc wurden nicht umgesetzt. Eine neoM-Mutante von S. fradiae wurde erzeugt und genotypisch und biochemisch charakterisiert. Durch die in trans Komplementation mit den Genen neoM, kanM1 und hygF konnte keine Bildung von AGAs nachgewiesen werden. # Die Tatsache, dass UDP-GlcNAc als einziges Substrat in den von NeoM und KanM1 katalysierten Glycosyltransferasereaktionen umgesetzt wurde, bedingte einen nachfolgenden Deacetylierungsschritt in den jeweiligen Biosynthesen. Es konnte gezeigt werden, dass die homologen Enzyme NeoD und KanN diese Reaktion katalysieren. Darüber hinaus wurde eine neoD-Mutante von S. fradiae erzeugt. Nach der genetischen und biochemischen Charakterisierung sollte die Mutante durch neoD und kanN komplementiert werden. Die Expression der Gene konnte nachgewiesen werden, eine Produktion von AGAs nicht. # Die in der Neomycinbiosynthese vorkommende Glycosyltransferase NeoF katalysiert die Bildung von 2'''-N-Acetyl-6'''-hydroxyneomycin C aus Ribostamycin und UDPGlcNAc. Sie zeigt ebenso wie NeoM und KanM1 eine hohe Donorsubstratspezifität. TDP-Glc oder UDP-Glc konnten nicht mit Ribostamycin umgesetzt werden. # Die Bildung von 2'''-N-Acetyl-6'''-hydroxyneomycin C bedingt in der Neomycinbiosynthese einen weiteren Deacetylierungsschritt. Dieser wird von NeoD katalysiert. Die Bildung von 6'''-Hydroxyneomycin C durch die Aktivität von NeoD konnte gezeigt werden. Das zu NeoD homologe KanN katalysiert diese Reaktion nicht. # Die in der Biosynthese von Kanamycin vorkommende Glycosyltransferase KanM2 konnte durch die Generierung einer entsprechenden Mutante charakterisiert werden. Diese Mutante bildete eine antibiotisch wirksame Substanz (Paromamin?).

English

Aminoglycoside antibiotics (AGAs) are important drugs in medical therapy. Specific modifications to these substances are necessary to circumvent resistance mechanisms of pathogens and to reduce toxic side-effects. An efficient way to modify these substances is represented by biocombinatorial approaches, for which a detailed understanding of the biosynthesis of the aminoglycosides is essential. Thus, the aim of this thesis was the characterization of the glycosyltransferases NeoM, NeoF, KanM1 and KanM2 and deacetylases NeoD and KanN of the neomycin and kanamycin biosyntheses from Streptomyces (S.) fradiae und S. kanamyceticus and, consequently, the further elucidation of the biosynthetic pathways. First biocombinatorial experiments to modify these substances were implemented. # The homologous enzymes NeoM and KanM1 were identified as 2-DOS : UDPGlcNAc glycosyltransferases (N-acetylparomamine synthases). After optimization of expression, in vitro enzyme assays were carried out. The heterologously overexpressed proteins showed high-level specificity for the donor substrate. Neither TDPGlc nor UDP-Glc were accepted as sugar donors by NeoM or KanM1. A neoM-knockout mutant of S. fradiae was generated and genotypically and biochemically analysed. However, after in trans complementation with the genes neoM, kanM1 and hygF, no production of AGAs was detected. # Due to the fact that UDP-GlcNAc was the only substrate accepted by NeoM and KanM1, a deacetylation step in the biosynthetic pathways was proposed. It was shown in this study that the enzymes NeoD and KanN catalyse this step in the respective pathway. A neoD mutant of S. fradiae was tried to be complemented by neoD and kanN, whereas the expression of the genes was detectable while no AGAs were produced. # The glycosyltransferase NeoF occurs in the neomycin biosynthetic pathway. It catalyses the formation of 2'''-N-acetyl-6'''-hydroxyneomycin C from ribostamycin and UDP-GlcNAc and showed, like NeoM and KanM1, high donor-substrate specificity. No glucose residue was transferred from TDP-Glc or UDP-Glc to ribostamycin by NeoF. # The formation of 2'''-N-acetyl-6'''-hydroxyneomycin C during neomycin biosynthesis requires a subsequent deacetylation reaction. This step is also catalysed by NeoD and resulted in the formation of 6'''-hydroxyneomycin C. The homologue to NeoD, KanN, was not able to catalyse this reaction. # The glycosyltransferase KanM2, which is specific for the kanamycin biosynthetic pathway, was characterised by knock-out mutagenesis of its gene. The mutant accumulated a substance which clearly showed antibiotic activity (paromamine?).