Deutsch

D-myo-Inositol 3-phosphat Synthase (MIPS) katalysiert die Umsetzung von D-Glucose 6-phosphat in D-myo-Inositol 3-phosphat, dem primären Schritt bei der Synthese von myo-Inositol in Archaebakterien und Eukaryonten. Myo-Inositol ist ein Baustein essentieller Moleküle, insbesondere Inositolphosphate, Phosphoinositolphosphate und GPI-verankerter Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neue Methode zur Bestimmung der D-myo-Inositol 3-phosphat Synthase Aktivität etabliert. Basierend auf dieser Methode wurde die D-myo-Inositol 3-phosphat Synthase aus D.discoideum identifiziert und partiell angereichert. Um Kenntnisse über den Inositolstoffwechsel von D.discoideum zu erhalten, wurden konditional letale, inositol-auxotrophe Mutanten über „gene replacement“ und Antisense-Mutagenese generiert. Die verringerte Expression der MIPS wurden durch Northern Blotting, Immunoblotting und Aktivitätstest in den Mutanten nachgewiesen. Im Gegensatz zum Wildtyp wachsen die inositol-auxotrophen Mutanten nur in Medien mit einem Zusatz an myo-Inositol. Unter inositollimitierenden Bedingungen zeigen die Mutanten mehrere Wachstumsdefekte. Sie konnten nicht auf Bakterienrasen oder in Bakteriensuspension wachsen. Auf inositolfreien Medien stellten sie ihr Wachstum ein, verloren ihre typische amöboide Form und starben nach 24 h. Eine Blockierung der Proteinbiosynthese oder Entzug der Kohlenstoffquelle konnte die Zellen vor diesem Tod bewahren. Daraus kann geschlossen werden, dass inositolhaltige Verbindungen essentiell für das vegetative Wachstum sind. Während des Inositolentzugs zeigten Mutanten aus der vegetativen Wachstumsphase Defekte in der Phagozytose, der Adhäsion und der EDTA-sensitiven Aggregation. Diese phänotypischen Veränderungen gingen einher mit abnehmenden myo-Inositol-, PtdIns- und PtdIns(4,5)P₂-Konzentrationen. Zusätzlich zeigten die Mutanten eine Zunahme an 2,3-Bisphosphoglycerat. Mögliche Erklärungen für diese Beobachtung werden diskutiert. In anderen untersuchten inositolhaltigen Verbindungen, beispielsweise Inositolphosphate, PtdIns(3)P, PtdIns(4)P und Diphosphoinositolphosphate, konnten keine weiteren Veränderungen beobachtet werden. Im Gegensatz zum vegetativen Wachstum zeigten die Mutanten während der Differenzierung nur geringe Defekte. Die Mutanten formten ungewöhnliche Aggregate mit mehrfachen Spitzen, jedoch zeigten die Fruchtkörper einen normalen Aufbau. Die Sporengermination war normal, jedoch verloren die Zellen ihre Vitalität sofort, wenn dem Medium kein myo-Inositol zugesetzt wurde.

English

D-myo-Inositol 3-phosphate synthase catalyses the conversion of D-glucose 6-phosphate to D-myo-inositol 3-phosphate, the primary reaction for the synthesis of myo-inositol in archaebacteria and eukaryotes. Myo-Inositol is a precursor of essential molecules like inositol phosphates, membrane phospholipids and GPI anchor proteins. In the present work a new method for the determination of D-myo-inositol 3-phosphate synthase activity was established. Based on this assay the D-myo-inositol 3-phosphate synthase of D.discoideum was identified and partially purified. To investigate the role of inositol-containing compounds in D.discoideum, conditional lethal, inositol-auxotrophic mutants were generated by gene replacement and antisense-mediated gene inactivation of the D-myo-inositol 3-phosphate synthase gene. The reduced expression of MIPS was proven by northern blots, immunoblots and enzymatic assays. In contrast to wild type cells the inositol-auxotrophic mutants grow only in media supplemented with myo-inositol. The mutants show several growth defects under inositol limiting conditions. They were unable to grow on bacterial lawns or in bacteria suspension. Transferred to myo-inositol-free medium the mutants stopped growth, lost their typical amoeboid form and died after 24 h. The cells can be protected from “inositolless death” by blocking the protein biosynthesis or carbon-starvation. It can be concluded that some inositol- containig compounds are essential for the vegetative growth. During myo-inositol starvation mutants from the vegetative growth phase show defects in phagocytosis, adhesion and EDTA-sensitive aggregation. These phenotypical changes were accompanied by a decrease of intracellular myo-inositol, PtdIns and PtdIns(4,5)P₂. In addition, the mutants show an increase of 2,3-bisphosphoglycerate. Possible explanations for this observation are discussed. No alterations were observed during myo-inositol starvation in the intracellular levels of other analysed inositol-containing compounds such as inositol posphates, PtdIns(3)P, PtdIns(4)P and diphospho myo-inositol phosphates. In contrast to the vegetative growth phase the mutants show only minor defects during differentiation. The mutants formed unusual aggregates with multiple tips but normal fruiting-body morphology. The spore germination was normally but the cells lost their vitality immediately in media lacking myo-inositol.