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- TitleScreening auf Rückstände von beta-Lactam-Antibiotika in Milch : Entwicklung eines optischen Biosensor-Assays mit Penicillin-bindenden Proteinen / von Giuseppe Cacciatore
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- Published
- Institutional NoteWuppertal, Univ., Diss., 2005
- LanguageGerman
- Document typeDissertation (PhD)
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English
A biospecific interaction assay (BIA) for the detection of residues of ß-lactam antibiotics in milk was developed using a surface plasmon resonance (SPR) biosensor. Penicillin-binding proteins (PBP), which are enzymes involved in the final stages of murein biosynthesis and represent the lethal target of ß-lactam antibiotics, were used as biomolecular recognition partners for penicillins and cephalosporins. PBP were mixed with samples, incubated and then labelled with an antigen-tagged ampicillin-derivative prior to SPR analysis with antibodies against the antigen-tag immobilised on the sensor chip. In order to detect residues of ß-lactam antibiotics at concentrations corresponding to maximum residue limits (MRL) set by the European Union, a suitable PBP, an antigen-tagged ampicillin-derivative and an antibody against the antigen had to be found. PBP of Streptococcus thermophilus and Bacillus stearothermophilus were partly purified by ampicillin affinity chromatography and a soluble derivative of PBP 2x of Streptococcus pneumoniae was expressed as a recombinant protein in Escherichia coli. This soluble PBP 2x-derivative, called PBP 2x, had higher affinities towards different ß-lactam antibiotics than the other studied PBP and was chosen for construction of the ß-lactam-specific BIA. Ampicillin (AMPI) was labelled with derivatives of digoxigenin (DIG), fluorescein (FLU) or 2,4 dinitrophenol (DNP). DIG, FLU and DNP were coupled through their activated N-hydroxysuccinimide esters to the amino group of AMPI, yielding DIG labelled AMPI (DIG AMPI), FLU labelled AMPI (FLU-AMPI) and DNP labelled AMPI (DNP-AMPI), respectively. DIG AMPI, FLU-AMPI and DNP AMPI were examined as antigen-tagged ampicillin-derivatives. Benzylpenicillin, ampicillin, amoxicillin, cloxacillin, cephalexin and cefoperazone could be detected in commingled raw milk at concentrations below their respective MRL using PBP 2x, DIG-AMPI and the monoclonal antibody against DIG for SPR analysis of milk samples. The SPR analysis of 20 raw milk samples from individual cows confirmed that matrix interferences are a critical point in BIAs as non-specific binding of matrix components to the sensor chip elevated the detection limit dramatically. Matrix interferences could be reduced to a lower and a more constant level by a heat treatment step and the addition of carboxymethylated dextran to the samples. With this additional sample preparation, individual samples containing benzylpenicillin at the MRL were identified as positive.
Deutsch
In dieser Arbeit wurde ein Screening-Test mit einem Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Biosensor (SPR Biosensor) entwickelt, um ß-Lactam-Antibiotika-Rückstände in Milch nachzuweisen. Als biomolekulare Erkennungspartner für Penicilline und Cephalosporine wurden Penicillin-bindende Proteine (PBP) eingesetzt. PBP sind das Target der ß-Lactam-Antibiotika im bakteriellen Stoffwechsel. Sie binden spezifisch Penicilline und andere ß-Lactam-Antibiotika, wobei die ß-Lactam-Antibiotika kovalent an das aktive Zentrum der PBP binden und PBP/ß-Lactam-Konjugate entstehen. Der Screening-Test basiert auf der Bindung eines Markermolekül-markierten Ampicillin-Derivates an ein PBP. Die PBP/Ampicillin-Konjugate werden durch eine SPR-Biosensor-Analyse mit Markermolekül-spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Verschiedene PBP, markierte Ampicillin-Derivate und Markermolekül-spezifische Antikörper wurden untersucht, um ß-Lactam-Antibiotika-Rückstände im Konzentrationsbereich der innerhalb der EU festgelegten Rückstandshöchstmengen (MRL Werte) nachzuweisen. PBP wurden zum einem aus den solubilisierten Membranproteinen von Streptococcus thermophilus und Bacillus stearothermophilus mittels Ampicillin-Affinitätschromatographie isoliert. Zum anderen wurde ein lösliches PBP 2x-Derivat aus Streptococcus pneumoniae (PBP 2x) als rekombinantes Protein in Escherichia coli überexpremiert. Aufgrund der höheren Affinitäten gegenüber ß-Lactam-Antibiotika wurde das PBP 2x als biomolekularer Erkennungspartner für die SPR-Biosensor-Analysen eingesetzt. Ampicillin (AMPI) wurde mit Digoxigenin- (DIG), 2,4 Dinitrophenyl- (DNP) und Fluorescein-Derivaten (FLU) markiert. Als Markermolekül-spezifische Antikörper wurden verschiedene polyklonale und monoklonale DIG- , DNP- und FLU-spezifische Antikörper untersucht. Von den PBP 2x/Ampicillin-Konjugaten konnte durch die SPR-Biosensor-Analyse nur das PBP 2x-Konjugat mit DIG-markiertem Ampicillin (DIG AMPI) und einem monoklonalen DIG-spezifischen Antikörper mit ausreichender Sensitivität und Reproduzierbarkeit bestimmt werden. Benzylpenicillin, Ampicillin, Amoxicillin, Cloxacillin, Cephalexin und Cefoperazon konnten mit diesen Reagenzien (PBP 2x*, DIG-AMPI und monoklonaler DIG-spezifischer Antikörper) in entfetteter Vollmilch und Rohmilch unterhalb der für diese ß- Lactam-Antibiotika festgesetzten Rückstandshöchstmengen nachgewiesen werden. Die Analyse von individuellen Rohmilch-Proben von 20 Kühen bestätigte die Erfahrung, dass die unspezifische Bindung von Matrix-Komponenten an den Sensor-Chip ein kritischer Faktor ist, der die Nachweisgrenze eines SPR-Biosensor-Assays erhöhen kann. Die Matrixinterferenzen konnten durch eine Hitze-Behandlung und die Zugabe von Carboxymethyldextran zu den analysierenden Proben auf ein konstantes und niedriges Niveau reduziert werden. Mit dieser Probenvorbereitung konnte Benzylpenicillin auch in den individuellen Rohmilch-Proben an der festgesetzten Rückstandshöchstmenge nachgewiesen werden.
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