Deutsch

Diese Dissertation behandelte zwei nur entfernt miteinander verwandte Teile – Genschwamm und Biosynthese der Acarbose. Die folgenden Aspekte und Ergebnisse wurden ausgearbeitet. I. Genschwamm:

Die grundlegenden Schritte für die Verwendung von Deletionsstämmen eines Streptomyceten als sogenannte Genschwämme, die der DNA-Aufnahme durch andere Mikroorganismen im Boden dienen, wurden durchgeführt. (1) Ein natürlicher Transfer eines nicht konjugativen Plamides, pIJ702, von S. lividans 66 TK23 auf den Stamm Jni13C1 konnte in sterilem Boden demonstriert werden; (2) Einige Isolate aus dem Boden mit Rezipientenphänotyp wurden durch PCR, RAPD und den Vergleich der genomischen DNA mit 16S rRNA-RFLPs und PFGE analysiert; (3) Drei Rekombinanten aus Konjugationsexperimenten mit Nicht-Deletionsstämmen und Deletionsstämmen von S. lividans resultieren aus Übertragungen, bei denen große DNA Fragmente (ca. 500 kb) aus dem linken Chromosomenarm in den Empfängerstamm integriert wurden. Zwei solcher Stämme, M3-1 und M1-107, hatten lineare Chromosomen mit duplizierten Endbereichen einschließlich eines Chloramphenicol Resistenzgenes an beiden Chromosomenden. II. Biosynthese der Acarbose

(1) Die Größe des Genomes von Actinoplanes sp. SE50/110 wurde auf ca. 6.5 Mb geschätzt. Das komplette Gencluster der Acarbose (acb) befindet sich als einfache Kopie auf einen ca. 45 kb XbaI/AseI Fragment; (2) Die Proteine, AcbK, M, L, N, O und U wurden heterolog in E. coli und/oder S. lividans in löslicher Form, meistens als His-tag Versionen, überproduziert; (3) Die Aktivität des AcbK Proteins wurde bestätigt und genutzt um die heterologe Produktion der Acarbose-verwandter Substanzen in einem S. lividans Stamm, der das komplette acb-Cluster enthielt, zu demonstratieren; (4) Das 1-epi-Valienol wurde als einziges der getesten Cyclitole durch Rohextrakte aus Actinoplanes sp. phosphoryliert; aber kein Acb-Protein wurde identifiziert, das diese Reaktion katalysiert; (5) Das 2-epi-5-epi-Valiolon wurde durch Transketolase und AcbC enzymatisch und präparativ synthesiert; (6) AcbM wurde als eine 2-epi-5-epi-Valiolon 7-Kinase charakterisiert und ihr Produkt wurde durch IC-MS und NMR analysiert; (7) 2-epi-5-epi-Valiolon-7-Phosphat wurde als das Substrat der Isomerase AcbO identifiziert, deren warscheinliches Produkt 5-epi-Valiolon-7-Phosphat ist; (8) Ein neuer Biosyntheseweg der Acarbose wird vorgestellt.

English

This dissertation falls into two only distantly related parts - "gene sponge" and acarbose biosynthesis. The following aspects and results have been worked on and achieved. I. Gene sponge:

The basic steps for the use of deletion strains of a streptomycete as so called "gene sponges" for picking up large-scale DNA from other microorganisms in soil have been done. (1) A natural transfer of a non-conjugative plasmid pIJ702 from S. lividans 66 TK23 to recipient strain Jni13C1 was demonstrated in sterile soil; (2) Some soil isolates with recipient phenotype were analyzed by PCR, RAPD, comparison of 16S rRNA-RFLPs and PFGE experiments on the genomic DNA; (3) Three conjugative recombinants from matings between non-deletion (donor) and deletion strains of S. lividans 66 resulted from transfer events, in which large DNA fragments (ca. 500 kb) from the left chromosomal arm were integrated into the recipient strains. Two of these, M3-1 and M1-107, had linear chromosomes with duplicated end regions including a chloramphenicol resistance gene at both ends of the chromosome. II. Acarbose biosynthesis:

(1) The genome size of Actinoplanes sp. SE50/110 was estimated to be of about 6.5 Mb and the complete acarbose gene cluster (acb) was localized on a 45 kb XbaI/AseI chromosomal fragment as a single copy; (2) The proteins, AcbK, M, L, N, O and U were heterologously overproduced in E. coli and/or S. lividans in soluble forms mostly as their His-tag versions; (3) The activity of AcbK was confirmed and used to demonstrate the heterologous production of acarbose-related compounds in a S. lividans strain containing the whole acb-cluster; (4) 1-epi-valienol was the only cyclitol phosphorylated by crude extracts of Actinoplanes sp.; but no Acb-proteins could be identified catalyzing this reaction; (5) The cyclitol precursor 2-epi-5-epi-valiolone was enzymatically and preparatively synthesized by use of transketolase and AcbC; (6) AcbM was characterized as a 2-epi-5-epi-valiolone 7-kinase and its product was characterized by IC-MS and NMR analysis; (7) 2-epi-5-epi-valiolone-7-phosphate was identified as the substrate for the isomerase AcbO, the product of which was likely to be 5-epi-valiolone-7-phosphate; (8) A new pathway for the biosynthesis of acarbose is presented.