Bibliographic Metadata
- TitleAromaten- und Chloraromatenabbau durch Pseudomonas sp. Stamm B 13: 3-Oxoadipat-SuccinylCoA-Transferase und 3-OxoadipylCoA-Thiolase / vorgelegt von Bernd Kuhn
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- Description1 Computerdatei (ca. 1,17 MB) : Auszüge (Titel, Danksagung, Inhaltsverzeichnis, Abbildungsverzeichnis, Tabellenverzeichnis, Abstract, ca. 46 KB)
- Institutional NoteWuppertal, Univ., Diss., 2002
- LanguageGerman
- Document typeDissertation (PhD)
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English
The degradation of 3-oxoadipate in Pseudomonas sp. strain B13, a chloroaromatics-degrading organism, was investigated and was shown to proceed through 3-oxoadipyl-CoA to give acetyl-CoA and succinyl-CoA.
The 3-oxoadipate:succinyl-CoA transferase of strain B13 was purified and estimation of the native Mr value gave 115 ± 5 kDa. Polyacrylamide gel electrophoresis under denaturing conditions resulted in two distinct bands of equal intensity. The subunit A and B values were 32.9 and 27.0 kDa. Therefore it was assumed that the enzyme is a heterotetramer of the type A2B2 with a Mr value of 119.8 kDa. The N-terminal amino acid sequences of both transferase subunits were obtained:
subunit A: AELLTLREAVERFVNDGTVALEGFTHLIPT; subunit B: SAYSTNEMMTVAAARRLKNGAVVFV.
KM and Vmax values were 0.4 mM and 10.3 U/mg protein for 3-oxoadipate, respectively, while 0.2 mM and 24.2 U/mg protein were the data for succinyl-CoA. The catalytical constant was 1430 min-1. The transferase of strain B13 failed to convert 2-chloro- and 2-methyl-3-oxoadipate. Some minor activity was observed with 4-methyl-3-oxoadipate. Even 2-oxoadipate and 3-oxoglutarate were shown to function as poor substrates of the transferase.
The 3-oxoadipyl-CoA thiolase was purified and estimation of the native Mr value gave 162 ± 13 kDa. The molecular mass of the subunit of the denatured protein, as determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, was found to be 42 kDa. On the basis of these results, 3-oxoadipyl-CoA thiolase should be a tetramer of the type A4. The N-terminal amino acid sequence of 3-oxoadipyl-CoA thiolase was determined to be SREVYI?DAVRTPIGRFG (? = unknown). KM and Vmax values were 0.15 mM and 1.5 U/mg protein for 3-oxoadipyl-CoA, respectively, while 0.01 mM and 0.9 U/mg protein were determined for CoA. The catalytical constant was 470 min-1.
Deutsch
Die 3-Oxoadipat:SuccinylCoA-Transferase und die 3-OxoadipylCoA-Thiolase aus Pseudomonas sp. B13 wurden gereinigt und untersucht. Eine Methode zum Nachweis verschiedener CoA-Ester durch HPLC wurde im Rahmen dieser Arbeit etabliert.Eine native Molekularmasse der B13-Transferase von 115 ± 5 kDa wurde ermittelt. Durch SDS-PAGE wurden zwei Enzymuntereinheiten A und B mit Größen von 32,9 und 27,0 kDa nachgewiesen. Diesen Daten entsprechend handelt es sich bei der B13-Transferase um ein heterotetrameres Enzym des Typs A2B2 mit einer Molekularmasse von 119,8 kDa. Die N-terminale Aminosäuresequenz der Enzymuntereinheiten der B13-Transferase wurden wie folgt bestimmt:
Untereinheit A: AELLTLREAVERFVNDGTVALEGFTHLIPT. Untereinheit B: SAYSTNEMMTVAAARRLKNGAVVFV.
Ein Vergleich dieser Sequenzen mit Transferasen aus anderen Aromaten-abbauenden Organismen belegt eine geringe Identität.
Die KM - und Vmax -Werte der Transferase betragen 0,4 mM bzw. 10,3 U/mgProtein für 3-Oxoadipat und 0,2 mM bzw. 24,2 U/mgProtein für Succinyl-CoA. Die katalytische Konstante beträgt 1430 min-1. Die B13-Transferase setzt keine in 2- und 4-Position halogenierten 3-Oxoadipate um. Auch 2-Methyl-3-oxoadipat ist kein Substrat der Transferase. Eine sehr geringe Transferase-Aktivität konnte gegenüber 4-Methyl-3-oxoadipat, sowie für 2-Oxoadipat und 3-Oxoglutarat gezeigt werden.
Eine native Molekularmasse der B13-Thiolase von 162 ± 13 kDa wurde bestimmt. Durch SDS-PAGE wurde eine Größe von 42 kDa für die Enzymuntereinheit der B13-Thiolase ermittelt. Entsprechend der gefundenen Daten ist die B13-Thiolase ein homotetrameres Enzym des Typs A4 mit einer Molekularmasse von 168 kDa. Die N-terminale Aminosäuresequenz der Enzymuntereinheit der B13-Thiolase wurde bestimmt:
Untereinheit: SREVYI?DAVRTPIGRFG (? = unbestimmte Aminosäure).
Ein Sequenzvergleich zu Thiolasen anderer Organismen zeigt einen hohen Grad an Übereinstimmung.
Die KM - und Vmax -Werte der B13-Thiolase betragen 0,15 mM bzw.1,5 U/mgProtein für 3-OxoadipylCoA und 0,01 mM bzw. 0,9 U/mgProtein für CoA. Die katalytische Konstante beträgt 470 min-1.
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