Deutsch

Ziel dieser Arbeit war es, die zwei bisher identifizierten Abschnitte des acb-Genclusters (acbC- und acbV-Subgencluster) aus Actinoplanes sp. SE50/110 zu einem durchgehenden acb-Gencluster zu ergänzen und neue Biosynthesegene zu identifizieren. Die Ergebnisse sind im Folgenden zusammengefasst: 1. Der rekombinante GEM12-Phage Φ 52 wurde durch DNA-DNA-Hybridisierung mit Gensonden aus beiden acb-Subgenclustern isoliert und die DNA-Sequenz des 20,13 kb großen Inserts des Phagen Φ 52 bestimmt. Dabei konnte gezeigt werden, dass Bereiche beider Subgencluster auf dem Insert des Phagen Φ 52 vorhanden waren. Die schon bekannten acb-Subgencluster und die in dieser Arbeit beschriebenen acb-Gene bildeten somit ein durchgehendes acb-Gencluster in Actinoplanes sp. SE50/110. 2. Basierend auf der DNA-Sequenz wurden 13 offene Leserahmen (acbIPRSUVWXYZ, asp52.1, asp52.2 und asp52.3) identifiziert; dabei waren die Gene acbI und asp52.3 nur partiell auf dem Insert des Phagen Φ 52 vorhanden. Aufgrund der postulierten Funktion ihrer Genprodukte gehörten die 10 mit acb- bezeichneten Gene zu dem acb-Gencluster aus Actinoplanes sp. SE50/110. 3. Mit den in dieser Arbeit beschriebenen acb-Genen konnte der vermutlich vollständige Genbestand des acb-Genclusters aus Actinoplanes sp. SE50/110 bestimmt und ein erweitertes Modell der Acarbose-Biosynthese entwickelt werden. 4. Zwischen dem acb-Gencluster aus Actinoplanes sp. SE50/110 und dem partiell analysierten acb-Gencluster aus Streptomyces glaucescens GLA.O bestehen signifikante Unterschiede in der Organisation und dem Genbestand. Sie sind nur entfernt miteinander verwandt. 5. Das rekombinante Cosmid pHTWCos6 wurde durch DNA-DNA-Hybridisierung einer Cosmidbank genomischer DNA von Actinoplanes sp. SE50/110 mit dem Gen acbC isoliert und für die heterologe Expression des acb-Genclusters in S. lividans 66 TK23 eingesetzt. Sein 41 kb großes Insert umfasste das gesamte acb-Gencluster. Die erfolgreiche Expression der acb-Gene wurde durch den Nachweis der Enzymaktivität der Acarviosyltransferase (AcbD), der Acarbose-7-Kinase (AcbK) sowie des AcbE-Proteins im Kulturfiltrat gezeigt. Weiterhin konnte in den Kulturüberständen von S. lividans 66 TK23 pHTWCos6 eine mit der Acarbose verwandte Substanz, möglicherweise das Biosyntheseintermediat Acarbose-7-phosphat, nachgewiesen werden, wodurch die Definition des acb-Genclusters bestätigte wurde. 6. Die Phosphorylierung des potentiellen Biosyntheseintermediates 1-epi-Valienol durch heterolog exprimierte acb-Gene konnte in vitro gezeigt werden. Wahrscheinlich wurde diese Reaktion durch die postulierte Cyclitol-Kinase AcbU katalysiert. Dies stützte die Vermutung, dass 1-epi-Valienol bzw. sein Phosphat 1-epi-Valienol-(7)-phosphat ein Intermediat der Acarbose-Biosynthese ist und durch eine Phosphorylierung, wahrscheinlich an der Position C-1 des Cyclitols, aktiviert wird.

English

The objective of this study was to examine the structure and entire gene set of the complete acb-gene cluster in Actinoplanes sp. SE50/110. 1. The GEM12-derivative Φ 52 was isolated by means of Southern hybridization with gene probes derived from both known subclusters of acb-genes. By sequencing the 20.13 kb insert of the phage Φ 52 the gap between both acb-subclusters were filled. The residual parts of the contiguous acb-gene cluster downstream of acbW also could be identified. 2. In the 20.13 kb DNA-fragment, 11 complete (acbPRSUVWXYZ, asp52.1 and asp52.2) and two incomplete open reading frames have been identified (acbI and asp52.3). All of the acb-genes are thought to belong to the acb-gene cluster. Except for the protein AcbI, a function in the metabolism of acarbose in Actinoplanes sp. SE50/110 could be assigned to all Acb-proteins on the basis of amino acid sequence similarity to known proteins. 3. Based on the deduced functions of all Acb-proteins a putative modell of the acarbose biosynthesis in Actinoplanes sp. SE50/110 was proposed. 4. Comparing the acb-gene clusters from Actinoplanes sp. SE50/110 and from S. glaucescens GLA.O siginificant differences in the organisation and the gene content were found implying that both gene clusters are only distantly related. 5. A genomic library of Actinoplanes sp. SE50/110 constructed in the shuttle vector pOJ446 was screened with a DNA-fragment containing the acbC gene. The isolated recombinant cosmid pHTWCos6 encompassed the complete acb-gene cluster and was used for the heterologous expression of the entire set of acb-genes in S. lividans 66 TK23. The enzymatic activities of the acarbose-7-kinase (AcbK) and the acarviosyltransferase (AcbD) were successfully detected by in vitro assays. The production of the α -amylase AcbE was shown by an SDS-PAGE of the culture filtrate confirming the expression of the acb-genes. Furthermore, the recombinant strain S. lividans 66 TK23 pHTWCos6 produced a new substance which was suggested to be acarbose-7-phosphate. 6. It was possible to phosphorylate 1-epi-valienol using cell free extracts of S. lividans 66 TK23 pHTWCos6 or pHTW214. This reaction was most likely catalyzed by the putative cyclitol kinase AcbU. These results suggested that 1-epi-valienol or the corresponding phosphate 1-epi-valienol-(7)-phosphate are intermediates of the biosynthesis of acarbose in Actinoplanes sp. SE50/110. Most likely, this intermediate becomes activated through phosphorylation at the C-1 position of the cyclitol, which would fit excellently into the proposed model of the biosynthesis of acarbose.