Deutsch

Im Rahmen dieser Arbeit wurden ligninolytische Enzyme verschiedener Pilzmycelien isoliert und charakterisiert. Anschließend erfolgten Untersuchungen zur biokatalytischen Anwendbarkeit der isolierten Enzyme. Zur Anregung der Ausschüttung ligninolytischer Enzyme wurde daher zu Beginn ein Anzuchtmedium für Weißfäulepilze auf der Grundlage einer Ablauge aus dem sauren Sulfitverfahren entwickelt. Durch die in der Ablauge vorliegenden Ligninderivate konnten zehn Pilzmycelien erfolgreich zur Ausschüttung ligninolytischer Enzyme angeregt werden. Die Mycelien von Agaricus brasiliensis, Grifola frondosa und Pleurotus ostreatus exprimierten jeweils zwei Laccasen, während von Clitycybe maxima, Hericium coralloides, Hericium erinaceus, Hypsizygus tessulatus, Pleurotus eryngii und Trametes versicolor jeweils eine Laccase ausschüttetet wurde. Das Pilzmycelium von C. viscosa exprimierte im Gegensatz zu den anderen Mycelien eine Manganperoxidase. Diese Manganperoxidase wurde bisher nach bestem Wissen des Autors noch nicht in wissenschaftlichen Veröffentlichungen beschrieben. Nach der erfolgreichen Anzucht der Weißfäulepilze auf dem oben beschriebenen Anzuchtmedium wurde ein Aufreinigungsprotokoll zur Isolierung der gebildeten Enzyme aus den Anzuchtmedien entwickelt. Im Anschluss an die erfolgreiche Isolierung der Enzyme wurden diese charakterisiert. Die Charakterisierung der Enzyme umfasste die Bestimmung der Molekülmasse per SDS-PAGE, des isoelektrischen Punktes, sowie photometrische Assays zur Untersuchung des pH Optimums, des Temperaturoptimums, der kinetischen Parameter und des Einflusses verschiedener Metallsalz- und Inhibitorlösungen auf die Enzymaktivität. Nach erfolgreicher Isolierung und Charakterisierung der Enzyme wurde eine Laccase von A. brasiliensis und die Manganperoxidase von C. viscosa zur ersten Anwendung auf Ligninmodellsubstanzen und Ablaugen aus der Zellstoff- und Papierindustrie ausgewählt, um erste Anhaltspunkte zu erhalten, ob durch Einsatz der Enzyme eine biokatalytische Spaltung von Ligninen zu monomeren aromatischen Bausteinen erreicht werden kann. Dies konnte sowohl bei Verwendung der Modellsubstanzen als auch bei der Inkubation der verdünnten Ablaugen mit beiden Enzymen bestätigt werden. Die biokatalytische Spaltung der Modellsubstanzen führte mit beiden Enzymen zu monomeren aromatischen Verbindungen, die nach dem Abbau teilweise oxidierte Substituenten aufwiesen. Ebenso konnten durch eine Inkubation der Prozessablaugen aus dem Sulfit- und dem Sulfatverfahren mit den Enzymen von A. brasiliensis und C. viscosa monomere aromatische Verbindungen gebildet werden, die erfolgreich mittels GCxGC-(Tof)MS identifiziert werden können. Hierbei handelte es sich um aromatische Verbindungen, die mit lignintypischen Seitengruppen (z.B. Methoxy-, Hydroxy- und Carboxylgruppen) substituiert waren.

English

In this work ligninolytic enzymes from several fungi were expressed, characterized and their applicability for biocatalysis was investigated. For this purpose at first a growth medium for white rot fungi based on a sulfite spent liquor was developed. The mycelia of Agaricus brasiliensis, Grifola frondosa and Pleurotus ostreatus expressed two laccases, while Clitycybe maxima, Hericium coralloides, Hericium erinaceus, Hypsizygus tessulatus, Pleurotus eryngii and Trametes versicolor produced a single laccase. The mycelium of C. viscosa expressed a manganese peroxidase, which had not been described to the best of the authors’ knowledge in the scientific literature before. After successful cultivation of white rot fungi on the medium described above a purification protocol for the isolation of enzymes was developed. Following the successful isolation the enzymes were characterized. The characterization of the enzymes included the determination of the molecular weight by SDS-PAGE, an isoelectric focussing, and photometric assays to examine the pH optimum, the temperature optimum, the kinetic parameters and the influence of various metal salt solutions and inhibitor on enzyme activity. After successful isolation and characterization of the enzymes, a laccase from A. brasiliensis and the manganese peroxidase from C. viscosa were selected for a first application on lignin model compounds and spent liquors from the pulp and paper industry. This was confirmed for model compounds as well as for spent liquors. The biocatalytic decomposition of the model compounds led to monomeric aromatic compounds with partially oxidized side chain. By the incubation of spent liquors from the sulfite and the sulfate pulping process with these enzymes monomeric aromatic compounds were formed, which could be successfully identified by GCxGC-(Tof)MS.