Deutsch

Diese Arbeit befasste sich mit dem Stickstoffstoffwechsel bei Actinoplanes sp. unter besonderer Berücksichtigung der Frage, wie der Stickstoff in den alpha-Glucosidaseinhibitor Acarbose während der Biogenese eingeführt wird. Zu klären galt es welches der postulierten Intermediate der Biosynthese transaminiert und durch welches Enzym diese Reaktion katalysiert wird. Heterologe PCR führte zur Identifizierung der Glutaminsynthetasen kodierenden Gene glnA und glnII auf dem Genom von Actinoplanes sp.. Das Vorkommen von mindestens zwei Glutaminsynthetasen deutet darauf hin, dass Actinoplanes einen von E. coli abweichenden, aber zu anderen Actinomyceten und im Boden lebenden Bakterien ähnlichen Stickstoffmetabolismus besitzt. Die Aufklärung einer möglichen Beteiligung dieser beiden Proteine an der Stickstoffbereitstellung für die Acarbosebiosynthese könnte für eine zukünftige Optimierung der industriellen Acarboseproduktion von Bedeutung sein. Hybridisierungsexperimente mit einer Gensonde aus S. glaucescens GLA.0 (acbB) führte zum Auffinden eines homologen Gens in Actinoplanes sp.. Eine physikalische Kartierung und DNA-Sequenzierung zeigten, das dieses als acbV bezeichnete Gen ca. 7 kb stromaufwärts von acbQ und anderen Acarbosebiosynthesegenen lokalisiert ist. Die abgeleitete Aminosäuresequenz zeigt mit ca. 30% die höchste Ähnlichkeit zu verschiedenen GabT-Proteinen. Diese zählen zur Subfamilie III der Aminotransferasen. Die Homologie von acbV zu acbB aus S. glaucescens beträgt 72,3% identische Aminosäuren. Die aufgrund der Aminosäuresequenzanalyse von AcbV aus Actinoplanes sp. postulierte Funktion als Aminotransferase sowie dessen homologes Protein AcbBSg aus S. glaucescens konnte experimentell untermauert werden. Nach heterologer Expression beider Proteine in E. coli und S. lividans TK23 und anschließenden Enzymtests mit Zellextrakten wurde gezeigt, dass dTDP-4-Keto-6-desoxyglucose mit L-Glutamat als Aminodonor spezifisch umgesetzt wird. Wahrscheinlich entsteht dTDP-D-4,6-Didesoxy-4-aminoglucose. Damit scheint nicht 2,5-epi-Valiol-1-amin, sondern dTDP-D-4,6-Didesoxy-4-aminoglucose die aminierte Vorstufe für die Bildung von Acarbose zu sein. Im Rahmen dieser Arbeit konnten drei weitere, in Nachbarschaft zum Acarbose-Biosynthesegencluster liegende Gene gefunden werden, acbU, acbW und acbX. Das Genprodukt von acbU enthält die für eine ATP-Bindung charakteristischen "Walker-Motive" und zeigt Ähnlichkeit zu den beide Pep2 Proteinen, die von zwei Glycogenbiosynthese-Genclustern aus S. coelicolor kodiert werden. Die abgeleiteten Proteine AcbW und AcbX zeigen signifikante Ähnlichkeit zu Proteinen der Superfamilie der ABC-Transporter. Sie könnten für den Acarbose-Export zuständig sein. Es konnte gezeigt werden, dass unter Verwendung der Gene acbV aus Actinoplanes sp. bzw. acbB aus S. glaucescens spezifisch Valienamin-haltige Sekundärmetabolit produzierende Streptomyceten identifiziert werden können. Von den Genen acbK (Acorbose-7-Kinase) und acbC (C7-Cyclitolsynthase) abgeleitete Hybridisierungssonden eignen sich nicht für das Screening von Produzenten bakterieller alpha-Glucosidaseinhibitoren.

English

This thesis deals with the nitrogen metabolism in Actinoplanes sp. and is focused on the incorporation of the amino nitrogen into the alpha-glucosidase inhibitor acarbose during its biogenesis. It should be clarified which of the postulated precursors serve as substrate for the transamination and which enzyme is responsible for its catalysis. Heterologous PCR revealed the existence of the genes glnA and glnII within the genome of Actinoplanes sp.. The occurrence of at least two genes encoding glutamine synthetases indicates that Actinoplanes sp. has a nitrogen metabolism, which may be similar to those of other actinomycetes and soil living bacteria. Further investigations will probably elucidate the implication of the two enzymes in nitrogen metabolism and the acarbose formation in Actinoplanes sp. during industrial fermentation processes. Using an acbB gene probe from of S. glaucesens GLA.0 in Southern hybridisation experiments led to the detection of an homologue gene in Actinoplanes sp. The homologous gene is located about 7 kb upstream of the acbQ gene and other acarbose biosynthetic genes as was shown by physical mapping and DNA sequencing of the hybridising fragment. The deduced amino acid sequence shares about 30% identity with various GabT proteins, which belong to the subfamily III of aminotransferases. The amino acid sequence homology of AcbV from Actinoplanes sp. to AcbB from S. glaucescens is 72.3%. The amino acid sequence analyses of AcbV from Actinoplanes sp. and AcbB from S. glaucescens suggested for both proteins a function as an aminotransferase. Enzyme assays using cell free extracts from S. lividans TK23, which was able to express heterologously both proteins, corroborated the assumed function. The nucleotide activated sugar dTDP-4-keto-6-desoxyglucose is converted by both proteins in the presence of L-glutamate probably to dTDP-D-4,6-didesoxy-4-aminoglucose. Consequently dTDP-D-4,6-didesoxy-4-aminoglucose and not 2,5-epi-valiol-1-amine seems to be the aminated precursor for the formation of acarbose. In the course of this study three additional genes, acbU, acbW, and acbX have been identified, which also seem to belong to the acarbose biosynthetic gene cluster. The gene product of acbU harbours typical "Walker-motives" indicating a putative ATP-binding site. Additionally, the deduced amino acid sequence shares similarity to the Pep2 proteins, which are encoded by the two glycogen biosynthetic gene clusters of S. coelicolor. The deduced proteins AcbW and AcbX show significant homology to proteins of the ABC transporter superfamily. They could be involved in the export of acarbose. Hybridisation probes derived from the genes acbV from Actinoplanes sp. or acbB from S. glaucescens are valuable tools in order to identify streptomycetes producing secondary metabolites of the valienamine type. On the other hand acbK (encoding acarbose 7-kinase) or acbC (encoding C7-cyclitol synthase) gene probes have not been useful for the screening of alpha-glucosidase inhibitor producers.