Bibliographic Metadata
- TitleGenetische und biochemische Untersuchungen von StrR - dem "pathway"-spezifischen Transkriptionsaktivator von Genen der Streptomycin-Biosynthese in Streptomyces griseus N2-3-11 / eingereicht von Sven Thamm
- Author
- Published
- Description1 Computerdatei (ca. 1,2 MB) : Auszüge (Titel, Danksagung, Inhaltsverzeichnis, Abkürzungsverzeichnis, Zusammenfassung, Summary, ca. 56 KB)
- Institutional NoteWuppertal, Univ., Diss.
- AnnotationSystemvoraussetzungen: Internet-Anschluss; Acrobat-Reader
- LanguageGerman
- Document typeDissertation (PhD)
- URN
- The document is publicly available on the WWW
- Social MediaShare
- Reference
- Archive
- IIIF
English
This work was focussed on the genetical and biochemical analysis of the pathway-specific transcriptional activator of genes of the streptomycin biosynthesis of S. griseus, StrR. A testsystem for screening of StrR-protein-mutants following site-directed and random mutagenesis was established. The functional domains for DNA-binding, oligomerization and transcriptional actvation were identified and analyzed and the following properties and functional domains could be assigned to the StrR-protein: The relatively central located helix-turn-helix (HTH)-motif of StrR was found to be responsible for the sequence-specific DNA-binding-activity. The deletion of merely one amino acid of the HTH-motif led to the loss of the DNA-binding activity. StrR binds as a tetramer to the palindromic binding-site of the strB1p-operator. StrR still interacts as a tetramer if only one half-site of the palindrome is present. The tetramerization-domain of StrR is located in the C-terminus of the protein. Point mutants of StrR harboring altered amino acids within the C-terminus as well as C-terminally truncated StrR-proteins lost their ability for tetramerization. The C-terminus of StrR is not necessary for the DNA-binding. The deletion of amino acids located C-terminally to the HTH-motif did not cause the loss of the DNA-binding-activity. StrR-point-mutants defective in the dimerization were not isolated. However, the dimeri-zation-domain must be located within the N-terminus of StrR because C-terminally truncated StrR-proteins still bound to DNA as dimeric protein-complexes. Amino acids responsible for transcriptional activation were found in the N- and C-terminus of the StrR-protein. The HstR-protein of S. glaucescens is a DNA-binding-protein and transcriptional activator of the StrR-family. Its HTH-motif exhibits the same DNA-specifity as StrR. However, this assignment could not be verified for the investigated SpcR-protein of S. flavopersicus. Even though S. griseus-RNA-polymerase and His-tag-StrR were successfully purified, no StrR-dependent in vitro transcriptional system could be established. In course of the development of this in vitro transcriptional system the growth phase-dependent production of StrR and the StrR-dependent StrB1-activity of two S. griseus strains were investigated. Although there were apparent differences in the quantity and the time-scale of the StrR-production, the StrB1-activities occured simultaneously in both strains at the entry into the stationary growth phase.
Deutsch
Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit stand die genetische und biochemische Analyse des "pathway"-spezifischen Transkriptionsaktivators von Genen der Streptomycin-Biosynthese, StrR aus Streptomyces griseus. Durch den Aufbau eines Testsystems zum Screening von StrR-Protein-Mutanten wurden die Voraussetzungen geschaffen, die funktionellen Domänen von StrR für die DNA-Bindung, Oligomerisierung und Transkriptionsaktivierung nach gerichteter und ungerichteter Mutagenese zu identifizieren und zu analysieren. Folgende Eigenschaften und funktionelle Domänen konnten dem StrR-Protein zugeordnet werden: Das relativ zentral im StrR-Protein gelegene Helix-Turn-Helix (HTH)-Motiv ist für die sequenz-spezifische DNA-Bindeaktivität von StrR verantwortlich. Bereits die Deletion einer Aminosäure innerhalb dieses HTH-Motivs führt zum Verlust der DNA-Bindeaktivität. StrR bindet als Tetramer an die palindrome Bindestelle des strB1p-Operators. Auch mit nur einer Hälfte dieser Bindestelle kann StrR noch als tetramerer Proteinkomplex interagieren. Die Domäne zur Tetramerisierung von StrR befindet sich im C-Terminus des Proteins. Punkt-mutanten von StrR mit veränderten Aminosäuren im C-Terminus verloren ebenso ihre Fähigkeit zur Tetramerisierung wie C-terminal verkürzte StrR-Proteine. Der C-Terminus von StrR ist für die DNA-Bindung nicht notwendig. Die Deletion der C-termi-nal vom HTH-Motiv gelegenen Aminosäuren führte nicht zum Verlust der DNA-Bindeaktivität solcher C-terminal verkürzter StrR-Proteine. Es wurden keine StrR-Protein-Mutanten isoliert, die nicht mehr zur Dimerisierung fähig waren. Jedoch kann aufgrund der vorliegenden Ergebnisse die Zuordnung der Dimerisierungs-Domäne zum N-Terminus von StrR getroffen werden, weil C-terminal vom HTH-Motiv verkürzte StrR-Proteine als dimere Proteinkomplexe an die DNA gebunden waren. Ausschließlich für die Transkriptionsaktivierung essentielle Aminosäuren wurden sowohl im N- als auch im C-Terminus des StrR-Proteins gefunden. Auch das Protein HstR aus S. glaucescens ist ein DNA-Bindeprotein und Transkriptionsaktivator der StrR-Familie. Mit seinem HTH-Motiv besitzt HstR die gleiche DNA-Sequenzspezifität wie StrR. Diese Zuordnung konnte für das hier ebenfalls untersuchte Protein SpcR aus S. flavopersicus bisher noch nicht verifiziert werden. Ein StrR-abhängiges in vitro Transkriptionssystem konnte trotz erfolgreicher Anreicherung von aktiver S. griseus-RNA-Polymerase und His-tag-StrR nicht etabliert werden. Vor dem Hintergrund des versuchten Aufbaus dieses in vitro Transkriptionssystems wurde die wachstumsphasenabhängige Produktion von StrR und die StrR-abhängige StrB1-Aktivität in zwei S. griseus-Stämmen untersucht. Dabei wurden Unterschiede sowohl in der Quantität als auch im zeitlichen Verlauf der StrR-Produktion festgestellt. Ein sprunghafter Anstieg der StrB1-Aktivitäten wurde dagegen in beiden S. griseus-Stämmen zeitgleich während des Übergangs in die stationäre Wachstumsphase beobachtet.
- The PDF-Document has been downloaded 12 times.