Deutsch

1. Zur Entwicklung einer Gensonde für den Abbau von DMSO durch Hyphomicrobium EG wurden die 16S rDNA von Hyphomicrobium EG, Hyphomicrobium sp1564, Hyphomicrobium sp1565 und Hyphomicrobium sp1566 amplifiziert, kloniert und sequenziert.
2. Aus einer variablen Region der Sequenzvergleiche der 16S rDNA konnte ein stammspezifischer Primer für Hyphomicrobium EG abgeleitet werden. Dieser konnte erfolgreich in PCR-Experimenten zum Nachweis von Hyphomicrobium EG in verschiedenen Bakterienmischungen eingesetzt werden.
3. Es konnte aus verschiedenen Wasserproben DNA isoliert werden. Diese DNA wurde in PCR-Experimenten eingesetzt, um Hyphomicrobium EG in den Wasserproben nachzuweisen. Dies gelang nur, wenn den Abwässern eine definierte Menge an Hyphomicrobium EG zugesetzt wurde. Die Nachweisgrenze für Hyphomicrobium EG lag bei 100 Keime/ml.
4. Das Schlüsselenzym des DMSO-Abbaus durch Hyphomicrobium EG, die Methylmercaptan Oxidase, konnte aufgereinigt und N-terminal ansequenziert werden. Desweiteren wurde das Protein mit Trypsin in Peptide gespalten, welche ebenfalls sequenziert wurden. Aus den Aminosäuresequenzen konnten Oligonukleotide abgeleitet werden, die zur Amplifizierung des beinahe vollständigen Methylmercaptan Oxidase Gens eingesetzt wurden. Aus diesem Genabschnitt konnten Primer abgeleitet werden, die zum Nachweis des spezifischen DMSO-Abbaus durch Hyphomicrobium EG eingesetzt werden konnten.
5. Zum Nachweis der anaeroben Reduktion von DMSO durch unspezifische Reduktasen konnten aus bekannten Sequenzen des Enzyms DMSO-Reduktase Oligonukleotide hergeleitet werden, die in PCR-Experimenten mit DNA aus Abwasserproben eingesetzt wurden. Dabei konnten unspezifische DMSO-Reduktase Aktivitäten in verschiedenen Abwässern nachgewiesen werden.
6. Aus dem Stamm Pseudomonas sp. B13 konnte mit Hilfe der N-terminalen Sequenzen der Untereinheiten der 3-Oxoadipat:Succinyl-CoA-Transferase ein 2.3 kbp großes DNA-Fragment isoliert und sequenziert werden. Die Sequenzanalyse deutet darauf hin, daß das Fragment das Gen der kompletten ß -Ketoadipyl-CoA-Thiolase, sowie Teile der Gene der ß -Ketoadipat:Succinyl-CoA-Transferase und der ß -Ketoadipat-Enol-Lacton-Hydrolase enthält.

English

For the development of a gene probe for the mineralization of DMSO by Hyphomicrobium EG the 16S rDNA of Hyphomicrobium EG, Hyphomicrobium sp.1564, Hyphomicrobium sp.1565 and Hyphomicrobium sp.1566 was amplified, cloned and sequenced. From these sequences a strain specific oligonucleotide for Hyphomicrobium EG could be found. This oligonucleotide was used for detecting Hyphomicrobium EG in different kind of bacterial mixtures. Hyphomicrobium EG could be detected likewise in different kind of natural water probes in a concentration of 100 bacteria/ml. For the development of a gene probe for the key enzyme of the DMSO degradation by Hyphomicrobium EG, the methylmercaptane oxidase, the enzyme was purified and digested with trypsin. The peptides were sequenced. Using certain oligonucleotides derived from these sequences the gene for the methylmercaptane oxidase was nearly complete amplified by PCR. From this gene fragment oligonucleotides were derived. With these oligonucleotides the gene of the methylmercaptane oxidase could be detected for the identification of the specific degradation of DMSO by Hyphomicrobium EG. DMSO could also be degraded to DMS by unspecifical reductases. For detecting this anaerobic reduction oligonucleotides were derived from known sequences of the enzyme DMSO reductase. These oligonucleotides could be used in PCR experiments for detecting the genes of the unspecific DMSO reductases in the different kind of natural water probes. From the strain Pseudomonas sp. B13 the enzyme ß-ketoadipate:succinyl-CoA transferase was purified and N-terminal sequenced previously. From these sequences oligonucleotides could be derived for amplification and sequencing a 2.3 kbp DNA fragment. It seems that this fragment contains the gene of the enzyme ß-ketoadipyl-CoA thiolase and part of the genes of the enzymes ß-ketoadipate:succinyl-CoA transferase and ß-ketoadipate-enol-lactone hydrolase.