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- TitleAnalyse von ausgewählten modifizierenden Enzymen aus den Aminoglycosidantibiotika-Biosynthesewegen von Neomycin, Lividomycin und Nebramycin / vorgelegt von Diana Clausnitzer
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- Institutional NoteWuppertal, Univ., Diss., 2010
- LanguageGerman
- Document typeDissertation (PhD)
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English
2-Deoxystreptamine (2-DOS) containing aminoglycosides (AGAs) are translational inhibitors acting on the 30 S subunit of the bacterial ribosome. Due to the protein synthesis inhibition AGAs are bactericidally active against gram-positive and gramnegative bacteria, and therefore they are used as broad-spectrum antibiotics. However, their application is limited by increasing resistances and also by side effects (nephroand ototoxicity). The chemical structure of 2-DOS-AGAs consists of the central aminocyclitol 2-DOS, to which one or more modified amino sugars are attached by glycosidic bonds. The 2-DOS core of the AGAs belonging to the neomycin (NEO) family is 4,5-disubstituted, in the kanamycin (KAN) family 2-DOS is 4,6-disubstituted. The aim of this thesis was to characterize specific AGA-modifying enzymes. The profound knowledge off the enzyme activities is a necessary precondition for generating selective enzymatic modifications and biocombinatorial approaches leading to new improved therapeutics. This work was focused on the analysis of the AGA-oxidoreductases (“Q”-enzymes) and their corresponding aminotransferases (“B”-enzymes). Therefore, the enzymes LivB and NeoB from S. lividus as well as the NeoB and NeoQ from S. fradiae were comparatively analyzed. In order to characterize the enzymes biochemically, different NEO-biosynthesis intermediates had to be synthesized enzymatically: 2’-Nacetylparomamine from paromamine using the AAC(2’) acetyltransferase, and the production of 2’’’-N-acetyl-6’’’-hydroxyneomycin C from ribostamycin and UDP-GlcNAC was catalyzed by NeoF. 2’’’-N-Acetyl-6’’’-hydroxyneomycin C could be subsequently deacetylated to 6’’’-hydroxyneomycin C employing the deacetylase NeoD. Applying newly established MTT/PMS coupled oxidoreductase-assays showed that NeoQ is bifunctional as predicted in the postulated biosynthesis pathway. NeoQ catalyzed the 6’-oxidation of the pseudodisaccharide paromamine and the 6’’’-oxidation of the pseudotetrasaccharide 6’’’-hydroxyneomycin C. However, LivQ only oxidized the 6’’’-hydroxyneomycin C and did not accept any pseudodisaccharide. Therefore, this enzyme is only monofunctional. Furthermore coupled assays were performed to find out, if the aminotransferases LivB or NeoB do aminate the aldehyde groups generated by the “Q”-enzymes. The NeoB enzyme catalyzed the amination of both substrates generated by NeoQ yielding to neamine and neomycin C (NEO-C), respectively. Surprisingly LivB was also able to aminate the two substrates. Therefore LivB, like NeoB, is also a bifunctional enzyme in vitro. Consequently LivQ is responsible for the fact that only the 6’’’-group is aminated in the LIV-synthesis, while in the NEO synthesis, 6’ and 6’’’ become aminated by NeoB. The nebramycines (NEB) produced by S. sp. DSM 40477 are the only 2-DOS-AGAs, which possess a carbamoyl-group. This study proved the postulated function of the carbamoyltransferase TobZ, which catalyzed the 6’’-carbamoylation of the substrates kanamycin B (KAN-B) to NEB-4 and tobramycin (TOB) to NEB-5’. Moreover KAN-A, that is structurally similar to TOB and KAN-B, but is not produced by S. sp. DSM 40477, was also modified by TobZ to 6’’-O-carbamoyl-kanamycin A. This new semisynthetic AGA has not been described in literature until now.
Deutsch
2-Desoxystreptamin (2-DOS) enthaltende Aminoglycosidantibiotika (AGAs) inhibieren durch Bindung an die ribosomale 30 S Untereinheit die Translation. Durch diese Hemmung der Proteinbiosynthese wirken sie sowohl bakterizid gegen grampositive als auch gramnegative Bakterien, und werden daher als Breitbandantibiotika eingesetzt. Zunehmende Resistenzen aber auch Nebenwirkungen (Nephro- und Ototoxizität) schränken die Anwendung ein. Strukturell bestehen 2-DOS-AGAs aus einem oder mehreren zum Teil stark modifizierten Aminozuckerresten die glykosidisch mit dem Aminocyclitol 2-DOS verknüpft sind. Dabei ist das 2-DOS in der Neomycin (NEO)- Familie 4,5-disubstituiert und in der Kanamycin (KAN)-Familie 4,6-disubstituiert. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung von Enzymen, die an spezifischen Modifizierungsschritten beteiligt sind. Detaillierte Kenntnisse der Enzymfunktionen schaffen die Möglichkeiten, durch gezielte enzymatische Modifikationen und biokombinatorische Ansätze neue, auch verbesserte Wirkstoffe zu generieren. Im Mittelpunkt der Arbeit standen Untersuchungen zu den AGA-Oxidoreduktasen („Q“- Enzyme) und die mit diesen Enzymen korrespondierenden Aminotransferasen („B“- Enzyme). Daher wurden die Enzyme LivB und LivQ aus S. lividus sowie NeoB und NeoQ aus S.fradiae vergleichend charakterisiert. Zum Nachweis der Enzymfunktionen mussten verschiedene Biosynthese-Intermediate der NEO-Biosynthese, die als potentielle Substrate der Enzyme eingesetzt werden sollten, enzymatisch synthetisiert werden: 2’-N-Acetylparomamin mittels einer AAC(2’)-Acetyltransferase aus Paromamin, 2’’’-N-Acetyl-6’’’-hydroxyneomycin C wurde in einem durch die Glycosyltransferase NeoF katalysierten Umsatz aus RIB und UDP-GlcNAc gebildet, und konnte durch die Deacetylase NeoD zu 6’’’-Hydroxyneomycin C umgesetzt werden. In einem neu etablierten MTT/PMS-gekoppelten Oxidoreduktasetest konnte gezeigt werden, dass NeoQ entsprechend der postulierten Biosynthese eine bifunktionale Oxidase ist, die die 6’-Oxidation des Pseudodisaccharids Paromamin und die 6’’’- Oxidation des Pseudotetrasaccharids 6’’’-Hydroxyneomycin C katalysiert. LivQ oxidierte nur 6’’’-Hydroxyneomycin C, und akzeptierte keines der eingesetzten Pseudodisaccharide und ist somit nur monofunktional. Des Weiteren wurde in gekoppelten Tests geprüft, ob die Aminotransferasen LivB bzw. NeoB die durch die „Q“-Enzyme gebildeten Aldehydgruppen aminieren. Dabei katalysierte NeoB die Aminierung der beiden durch NeoQ gebildeten Substrate zu Neamin beziehungsweise Neomycin C (NEO-C). Überraschend war jedoch, dass LivB ebenfalls in der Lage war, beide Substrate zu aminieren und damit in vitro ebenso wie NeoB bifunktional ist. Somit ist LivQ verantwortlich dafür, dass, im Gegensatz zur NEO-Synthese, bei der LIV-Synthese nur die 6’’’-Gruppe aminiert wird. Die von S. sp. DSM 40477 produzierten Nebramycine (NEB) sind die einzigen 2-DOSAGAs die eine Carbamoylgruppe aufweisen. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die postulierte Carbamoyltransferase TobZ die 6’’-Carbamoylierung der Substrate Kanamycin B (KAN-B) und Tobramycin (TOB) zu NEB-4 und NEB-5’ katalysiert. Aber auch das strukturell ähnliche und nicht in S. sp. DSM 40477 vorkommende AGA KAN-A konnte durch TobZ zu 6’’-O-Carbamoyl-kanamycin A carbamoyliert werden. Dieses semi-synthetische AGA wurde bisher in der Literatur noch nicht beschrieben.
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