Deutsch

Das Pseudotetrasaccharid Acarbose ist seit 1990 als kompetitiver Inhibitor intestinaler α-Glucosidasen (GlucobayTM/PrecoseTM) in der medizinischen Anwendung bei der Therapie von Diabetes mellitus Typ-2. Charakteristisch für die Struktur der Acarbose ist die Acarviosyleinheit, bei der Valinamin und Desoxyglucose N-glycosidisch verknüpft sind; des Weiteren ist an die Acarviosyleinheit ein Maltosylrest gebunden. Der Inhibitoreffekt beruht auf der irreversiblen Bindung zwischen dem Enzym und der Acarviosyleinheit. Neben dem Acarbose-Biosynthese- Gencluster aus dem Gram-positiven Bakterium Actinoplanes sp. SE50/110 (ATCC 31044) (acb-Gencluster, Y18523), konnte in unserer Arbeitsgruppe ein weiteres Acarbose-Biosynthese-Gencluster aus Streptomyces sp. GLA.O (DSM 40716) (gac- Gencluster, AM409314) identifiziert werden. Sowohl im acb- als auch im gac- Gencluster sind neben den Genen, die für Enzyme der Acarbose-Biosynthese codieren, weitere Gene, die für ein Export- und Importsystem sowie für katabole Enzyme codieren, vorhanden. Die außergewöhnliche Proteinausstattung und auch der Befund, dass Maltose und Maltotriose als Induktoren der Synthese einiger Schlüsselenzyme des Acarbosemetabolismus fungieren, führten zu der Annahme eines Carbophor-Modells, welches die physiologische Bedeutung der Acarbose im Ökosystem der Produzentenstämme erklärte als einen integrierten intra- und extrazellulären hoch entwickelten Stärkemetabolismus, in dem Acarbose, neben der Inhibitorfunktion gegenüber Nahrungskonkurrenten zusätzlich, analog den Eisen- Siderophoren, eine Carbophor-Funktion als Kohlenhydrat-bindendes und - importierendes Molekül übernimmt. Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Charakterisierung der extra- und intrazellulären amylolytischen Enzyme der Acarboseproduzentenstämme Actinoplanes sp. und Streptomyces sp.. Die Optimierung der Proteinproduktion erfolgte in dem α-Amylasedefizienten Stamm S. lividans TK24M2. Die biochemische Charakterisierung der Produkte, resultierend aus den Enzymtests, sowie die Charakterisierung der Kulturüberstände wurde mit einer, in dieser Arbeit entwickelten und etablierten neuen Methode zur Analyse von Maltooligosacchariden durch HPLC-ECD Analytik, durchgeführt. Die Enzyme AcbZ und AcbE aus Actinoplanes sp. sowie GacZ1 und GacE2 aus S. glaucescens konnten eindeutig als Acarbose-resistente, extrazelluläre α-Amylasen identifiziert werden. Die Enzyme wurden auf ihre Substratspezifität analysiert und es zeigte sich, dass neben Stärke auch Pullulan von diesen Enzymen degradiert werden kann. Somit wurde bestätigt, dass Actinoplanes sp. und Streptomyces sp. in Gegenwart von Acarbose mithilfe dieser Enzyme in der Lage sind, Stärke und Pullulan zu hydrolysieren. Die intrazelluläre 4-α-Glucanotransferase AcbQ aus Actinoplanes sp. katalysiert die Deglucosylierung der intrazellulären phosphorylierten Acarbose-Homologen und hydrolysiert ebenso auch langkettige Maltodextrine. Die nur in S. glaucescens sp. vorkommende intrazelluläre .- Glucosidase GacE1, ist auch Acarbose-resistent und katalysiert, analog zu AcbQ die Hydrolyse von Stärke und langkettigen Maltodextrinen. Das Carbophor-Modell konnte im Rahmen dieser Arbeit durch die erzielten Daten eindeutig belegt werden.

English

The pseudotetrasaccharide acarbose has been used since 1990 as a α- glucosidase inhibitor (GlucobayTM/PrecoseTM) for an efficient treatment of diabetes type II. The characteristic structure of acarbose consits of an acarviosyl-core. This pseudodisaccharide in which valinamine and a 6-deoxyglucose are linked via an N-glycosidic bond is attached to a maltose unit. The inhibitory effect of acarbose on α-glucosidases is based on the interactive binding of the enzymes to the acarviosyl-core. In addition to the well known acarbose biosynthesis gene cluster from Actinoplanes sp. SE50/110 (ATCC 31044) (acb gene cluster, Y18523), recently, a second gene cluster from Streptomyces glaucescens GLA.O (DSM 40716) (gac gene cluster, AM409314) was identified. The acb and the gac gene cluster both encode enzymes for the acarbose-biosynthesis as well as additional genes encoding for export and import systems and catabolic enzymes. The exceptional protein equipment and the finding that maltose and maltotriose were identified as inducers of the key enzyme production, lead to the proposal of a carbophor-model. This carbophormodel defines the physiological impact of acarbose inside the ecological system of the producer strains as an integrated intra- and extra cellular acarbose/starch metabolism, in which acarbose acts as an inhibitor for competitors in nutrition and in addition as a catcher for carbohydrates. The exploratory focus of this dissertation was the characterization of the amylolytic enzymes of the producer strains Actinoplanes sp. and Streptomyces glaucescens GLA.O. The production of the proteins of interest was improved using theα-amylase deficient strain S. lividans TK24M2. The biochemical characterization and the analysis of the pattern of the hydrolysates obtained with the different enzymes were determined by a new HPLC method, which was developed and established for analyzing oligosaccharides. The enzymes AcbZ and AcbE from Actinoplanes sp. and GacZ1 and GacE2 from S. glaucescens were clearly identified as acarbose-resistent extra cellular α-amylases. The substrate specificities of the enzymes were characterized and it was shown that the enzymes were able to degrade starch and pullulan even in the presence of acarbose. The acarbose insensitive cytoplasmatic 4-α-glucanotransferase AcbQ from Actinoplanes sp. catalyzes the deglucosylation of the intra cellular phosphorylated acarbose-homologous and also hydrolyzes longer maltodextrines. The intra cellular α-glucosidase GacE1, which is present only in S. glaucescens GLA.O, is also acarbose-resistent and catalyzes the hydolysation of starch and maltodextrines. The data obtained close a further gap of the carbophor-model and finally proof the function of acarbose being the first carboph.