Kapillarelektrophoretische Bestimmung von DNA-Addukten als Biomarker der chemischen Kanzerogenese / vorgelegt von Michaela Wirtz. 2006
Inhalt
- Einleitung
- 2 Theoretische Grundlagen
- 2.1 Krebs und krebserzeugende Faktoren
- 2.2 Molekulare Grundlagen und Mechanismen der Krebsentstehung
- 2.3 DNA-Addukte
- 2.3.1 Exogene DNA-Addukte
- 2.3.2 Endogene DNA-Addukte
- 2.3.3 Oxidativer Streß
- 2.3.4 Nachweismethoden für DNA-Addukte
- 2.4 DNA-Methylierung
- 2.5 Kapillarelektrophorese
- 2.5.1 Die LIF-Detektion in der Kapillarelektrophorese
- 2.5.2 Fluoreszenzdetektion in CAE-Systemen
- 2.5.3 LIF-Detektoren in der CE
- 3 Problemstellung und Zielsetzung
- 4 Ergebnisse und Diskussion
- 4.1 Standardisierung der CE LIF-Methode zur Methylierungsbestimmung
- 4.1.1 Optimierung der Probenvorbereitung für 1 µg und 100 ng DNA
- 4.1.2 Ermittlung von Korrekturfaktoren zur Bestimmung des Methylierungsgrades für 10 µg, 1 µg und 100 ng DNA
- 4.1.3 Betrachtung diverser Bereiche in einem Elektropherogramm
- 4.1.4 Erhöhung des Probendurchsatzes und der Routinetauglichkeit
- 4.1.5 Überprüfung der Korrekturfaktoren mittels Lambda-DNA (unmethyliert) bei 10 µg
- 4.1.6 Reproduzierbarkeit
- 4.1.7 Dokumentation relevanter Probenvorbereitungsparameter
- 4.2 Bestimmung des genomischen Methylierungsgrades
- 4.2.1 Analyse von 10 µg DNA aus Caco2-Zellen
- 4.2.2 Analyse von 100 ng DNA aus Brustkrebs-Zellen
- 4.2.3 Analyse des genomischen Methylierungsgrades in DNA von Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie
- 4.2.3.1 Prognosefaktoren in der chronisch lymphatischen Leukämie
- 4.2.3.2 Ergebnisse der Analyse des genomischen Methylierungsgrades von 29 Patienten mit B-CLL
- 4.2.4 Bestimmung des genomweiten Methylierungsgrades von DNA aus Rin- derföten nach in vitro- und in vivo-Fertilisation
- 4.3 Nachweis endogener DNA-Addukte mittels CE-LIF
- 4.3.1 Standardverbindungen für die Analyse endogener DNA-Addukte
- 4.3.2 Co-chromatographische Analyse von endogenen Addukten in mitochon- drialer und genomischer DNA aus Rinderleber und humanem Blut
- 4.3.3 Optimierung der kapillarelektrophoretischen Bedingungen für den Nachweis der endogenen Addukte
- 4.3.4 Bestimmung der Korrekturfaktoren für die synthetisierten endogenen Addukte
- 4.3.5 Quantifizierung von etheno-dAMP und dUMP in in vivo-Proben
- 4.3.6 Analyse von etheno-dAMP bei einer gesunden Person
- 4.4 Steigerung der Empfindlichkeit durch Konstruktion eines neuen LIF-Detektors
- 4.4.1 Theoretische Vorüberlegungen
- 4.4.2 Der experimentelle Aufbau des LS-CCD-Detektionssystems
- 4.4.3 Ankopplung des LS-CCD-Systems an die CE
- 4.4.4 Laserjustierung nach Einbau einer Kapillare
- 4.4.5 Einfluß verschiedener Parametereinstellungen der CCD-Kamera
- 4.4.6 Wahl des Ausschnittes in der Bilddarstellung
- 4.4.7 Sensitivitätsvergleich zwischen CE-LIF und CE-LS-CCD
- 4.4.8 Linearität des LS-CCD-Systems
- 4.4.9 Sensitivitätssteigerung durch Einsatz einer kubischen Kapillare
- 4.5 Erhöhung des Probendurchsatzes durch Konstruktion einer Multikapillarenanordnung
- 4.5.1 Vorbereitung und Entwicklung einer Multikapillarenanordnung
- 4.5.2 Analyse von CT-DNA mit der Multikapillarenanordnung
- 4.6 Ausblick
- 5 Zusammenfassung
- 6 Experimenteller Teil
- 6.1 Herstellung des Enzymmixes (MN/SPD) für die DNA-Hydrolyse
- 6.2 DNA-Quantifizierung
- 6.3 Probenvorbereitungsvorschriften (PVV)
- 6.4 Proteinabtrennung über eine Größenmembran
- 6.5 Lagerung der Proben
- 6.6 Durchführung der kapillarelektrophoretischen Messungen
- 6.6.1 Vorbereitungen der Kapillaren
- 6.6.1.1 heat-curing (runde Kapillare)
- 6.6.1.2 Präparation des Detektorfensters
- 6.6.1.3 Konditionierung
- 6.6.2 Spülen der Kapillaren
- 6.6.2.1 Spülen der Kapillare bei den Analysen unter MEKC-Bedingungen
- 6.6.2.2 Spülen der Kapillare bei den Analysen unter CZE-Bedingungen
- 6.6.3 Herstellen der Trennelektrolyten
- 6.6.4 Kapillarelektrophoretische Analysenmethoden
- 6.7 Geräte und Materialien
- 6.8 Sonstige Software
- 6.9 Chemikalien
- Anhang
- 8 Literaturverzeichnis