Untersuchungen zum Mechanismus der Kondensation zwischen trans-4-n-Propyl-L-prolin und alpha-Methylthiolincosaminid in der Lincomycin-A-Biosynthese aus [...] / eingereicht von Malte Haase. 2004
Inhalt
- Inhaltsverzeichnis
- Abkürzungen
- Zusammenfassung
- Summary
- 1 Einleitung
- 1.1 Merkmale der Streptomyceten
- 1.1.1 Aufbau des Streptomycetengenoms
- 1.1.2 Antibiotika-Biosynthese und -Resistenz
- 1.1.3 Das Lincomycin€A-Biosynthesecluster
- 1.2 Lincosamid-Antibiotika
- 1.3 Lincomycin-Biosynthese
- 1.4 Zielsetzung dieser Arbeit
- 2 Material und Methoden
- 2.1 Chemikalien und Enzyme
- 2.2 Medien
- 2.3 Bakterien und Plasmide
- 2.4 Oligonucleotide
- 2.5 Kulturbedingungen und Lagerung von Bakterien
- 2.5.1 Anzucht und Lagerung von E. coli
- 2.5.2 Anzucht und Lagerung von Actinomyceten
- 2.5.3 Anzucht und Lagerung von M. luteus
- 2.6 Biochemische Charakterisierung verwendeter S.€lincolnensis-Stämme
- 2.6.1 Bioassasy zum Nachweis von Lin€A-Produktion
- 2.6.2 Bioautographie zum Nachweis von Lin €A-/NDL-Produktion
- 2.6.3 Nachweis vom PPL aus S.€lincolnensis-Kulturen
- Nachweis der Lin€A-/NDL-Produktion mittels HPLC (Asmus et al., 1983)
- 2.7 Molekularbiologische Methoden
- 2.7.1 Isolierung von Nucleinsäuren
- 2.7.2 Gelelektrophorese von Nucleinsäuren
- 2.7.3 In vitro Manipulation von DNA
- 2.7.4 Elution von DNA aus Agarosegelen
- 2.7.5 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
- 2.7.6 Southern Blotting und DNA-DNA-Hybridisierung
- 2.7.7 Sequenzierung von DNA
- 2.7.8 Polymerasekettenreaktion (PCR)
- 2.7.9 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA
- 2.7.10 Herstellung von ss-DNA zur Transformation von S. lincolnensis NRRL 2936
- 2.8 Bestimmung der Proteinkonzentration
- 2.9 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
- 2.10 Immobilisierung von Proteinen auf PVDF-Membran
- 2.11 Immunologischer Nachweis immobilisierter His-tag-Proteine
- 2.12 Heterologe Genexpression
- 2.12.1 Heterologe Genexpression in E. coli unter Kontrolle des Promotors PT7(10
- 2.12.2 Heterologe Genexpression in E. coli unter Kontrolle des Promotors PrhaBAD
- 2.12.3 Heterologe Genexpression in S. lividans unter Kontrolle des Promotors PermE*
- 2.12.4 Heterologe Genexpression in S. lividans unter Kontrolle des Promotors PtipA
- 2.13 Gewinnung zellfreier Extrakte von E. coli und Streptomyces
- 2.14 Reinigung von His-tag-Proteinen mittels Ni2+-NTA-Agarose
- 2.15 Enzymtests
- 2.15.1 ATP/PPi-Austausch
- 2.15.2 Posttranslationale Modifikation von His-tag-LmbN und -LmbPCP mit [3H]-4‘-Phosphopantethein
- 2.15.3 Beladung von holo-His-tag-LmbN/-LmbPCP mit [3H]-PPL
- 2.15.4 In vitro NDL-Synthese
- 2.16 Analyse von DNA- und Aminosäuresequenzen
- 3 Ergebnisse
- 3
- 3.1 Der Leserahmen lmbC
- 3.1.1 Erzeugung einer lmbC-Knock-out-Mutante
- 3.1.2 Genetische Charakterisierung der lmbC-Knock-out-Mutante
- 3.1.3 Biochemische Charakterisierung der lmbC-Knock-out-Mutante
- 3.1.4 Komplementation der lmbC-Knock-out-Mutante
- 3.2 Heterologe Expression des Gens lmbC
- 3.2.1 Heterologe Expression des Gens lmbC in E.€coli BL21(DE3)pLysS
- Anreicherung von His-tag-LmbC aus E.€coli BL21(DE3)pLysS
- 3.3 Nachweis der LmbC-katalysierten Enzymaktivität
- 3.3.1 Qualitativer Nachweis der durch His-tag-LmbC-katalysierten ATP/PPi-Austauschreaktion in Abhängigkeit von trans-4-n-Propyl-l-prolin, l-DOPA und l-Tyrosin
- 3.3.2 Qualitativer Nachweis der His-tag-LmbC-katalysierten ATP/PPi-Austauschreaktion in Abhängigkeit verschiedener Aminosäuren mit ringhaltigen und offenkettigen Seitengruppen
- 3.3.3 Enzymkinetik und Substratspezifität von His-tag-LmbC
- 3.4 Das Gen lmbN
- 3.4.1 Sequenzüberprüfung des Gens lmbN
- 3.4.2 Ist LmbN ein bifunktionelles Enzym?
- 3.4.3 Expression von lmbN
- 3.4.4 Expression von lmbPCP
- 3.4.5 Beladung von His-tag-LmbN und His-tag-LmbPCP mit [3H(U)]-PPL
- 3.4.5.1 In vitro-Beladung des gereinigten His-tag-LmbN bzw. His-tag-LmbPCP mit [3H(U)]-PPL
- 3.4.5.2 In vitro Protein-Beladung mit [3H(U)]-PPL in Extrakten LmbC˚ und LmbN-produzierender E. coli
- 3.4.5.3 In vitro-Beladung mit [3H(U)]-PPL in Extrakten LmbC- und LmbN-produzierender S.€lividans
- 3.4.6 Versuche zur in vitro NDL-Synthese aus PPL und MTL
- 3.5 Erzeugung einer lmbN-Deletionsmutante
- 4 Diskussion
- 4.1 LmbC, die PPL-Adenylat Synthetase
- 4.2 LmbN/LmbPCP, eine Domänenfusion an ein Fremdprotein?
- 4.3 Perspektiven
- 5 Literaturverzeichnis