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Untersuchungen zum Mechanismus der Kondensation zwischen trans-4-n-Propyl-L-prolin und alpha-Methylthiolincosaminid in der Lincomycin-A-Biosynthese aus [...] / eingereicht von Malte Haase. 2004
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Inhaltsverzeichnis
Abkürzungen
Zusammenfassung
Summary
1 Einleitung
1.1 Merkmale der Streptomyceten
1.1.1 Aufbau des Streptomycetengenoms
1.1.2 Antibiotika-Biosynthese und -Resistenz
1.1.3 Das Lincomycin€A-Biosynthesecluster
1.2 Lincosamid-Antibiotika
1.3 Lincomycin-Biosynthese
1.3.1 MTL-Biosynthese
1.3.2 PPL-Biosynthese
1.3.3 Der Kondensations-Mechanismus
1.3.3.1 Das Adenylat-bildende Enzym
1.3.3.2 Das Carrierprotein
1.4 Zielsetzung dieser Arbeit
2 Material und Methoden
2.1 Chemikalien und Enzyme
2.2 Medien
2.2.1 Nährmedien
2.2.1.1 Medien für E. coli
2.2.1.2 Medien für Actinomyceten
2.2.2 Antibiotika
2.3 Bakterien und Plasmide
2.4 Oligonucleotide
2.5 Kulturbedingungen und Lagerung von Bakterien
2.5.1 Anzucht und Lagerung von E. coli
2.5.2 Anzucht und Lagerung von Actinomyceten
2.5.3 Anzucht und Lagerung von M. luteus
2.6 Biochemische Charakterisierung verwendeter S.€lincolnensis-Stämme
2.6.1 Bioassasy zum Nachweis von Lin€A-Produktion
2.6.2 Bioautographie zum Nachweis von Lin €A-/NDL-Produktion
2.6.3 Nachweis vom PPL aus S.€lincolnensis-Kulturen
Nachweis der Lin€A-/NDL-Produktion mittels HPLC (Asmus et al., 1983)
2.7 Molekularbiologische Methoden
2.7.1 Isolierung von Nucleinsäuren
2.7.2 Gelelektrophorese von Nucleinsäuren
2.7.3 In vitro Manipulation von DNA
2.7.4 Elution von DNA aus Agarosegelen
2.7.5 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
2.7.6 Southern Blotting und DNA-DNA-Hybridisierung
2.7.7 Sequenzierung von DNA
2.7.8 Polymerasekettenreaktion (PCR)
2.7.9 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA
2.7.10 Herstellung von ss-DNA zur Transformation von S. lincolnensis NRRL 2936
2.8 Bestimmung der Proteinkonzentration
2.9 Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
2.10 Immobilisierung von Proteinen auf PVDF-Membran
2.11 Immunologischer Nachweis immobilisierter His-tag-Proteine
2.12 Heterologe Genexpression
2.12.1 Heterologe Genexpression in E. coli unter Kontrolle des Promotors PT7(10
2.12.2 Heterologe Genexpression in E. coli unter Kontrolle des Promotors PrhaBAD
2.12.3 Heterologe Genexpression in S. lividans unter Kontrolle des Promotors PermE*
2.12.4 Heterologe Genexpression in S. lividans unter Kontrolle des Promotors PtipA
2.13 Gewinnung zellfreier Extrakte von E. coli und Streptomyces
2.14 Reinigung von His-tag-Proteinen mittels Ni2+-NTA-Agarose
2.15 Enzymtests
2.15.1 ATP/PPi-Austausch
2.15.2 Posttranslationale Modifikation von His-tag-LmbN und -LmbPCP mit [3H]-4‘-Phosphopantethein
2.15.3 Beladung von holo-His-tag-LmbN/-LmbPCP mit [3H]-PPL
2.15.4 In vitro NDL-Synthese
2.16 Analyse von DNA- und Aminosäuresequenzen
3 Ergebnisse
3
3.1 Der Leserahmen lmbC
3.1.1 Erzeugung einer lmbC-Knock-out-Mutante
3.1.1.1 Konstruktion des Suizid-Vektors pMHW27
3.1.1.2 Isolierung der lmbC-Knock-out-Mutanten
3.1.2 Genetische Charakterisierung der lmbC-Knock-out-Mutante
3.1.3 Biochemische Charakterisierung der lmbC-Knock-out-Mutante
3.1.4 Komplementation der lmbC-Knock-out-Mutante
3.2 Heterologe Expression des Gens lmbC
3.2.1 Heterologe Expression des Gens lmbC in E.€coli BL21(DE3)pLysS
Anreicherung von His-tag-LmbC aus E.€coli BL21(DE3)pLysS
3.3 Nachweis der LmbC-katalysierten Enzymaktivität
3.3.1 Qualitativer Nachweis der durch His-tag-LmbC-katalysierten ATP/PPi-Austauschreaktion in Abhängigkeit von trans-4-n-Propyl-l-prolin, l-DOPA und l-Tyrosin
3.3.2 Qualitativer Nachweis der His-tag-LmbC-katalysierten ATP/PPi-Austauschreaktion in Abhängigkeit verschiedener Aminosäuren mit ringhaltigen und offenkettigen Seitengruppen
3.3.3 Enzymkinetik und Substratspezifität von His-tag-LmbC
3.4 Das Gen lmbN
3.4.1 Sequenzüberprüfung des Gens lmbN
3.4.2 Ist LmbN ein bifunktionelles Enzym?
3.4.3 Expression von lmbN
3.4.3.1 Expression von lmbN in E.€coli
3.4.3.2 Expression von lmbN in S. lividans
3.4.4 Expression von lmbPCP
3.4.4.1 Posttranslationale Modifikation von His-tag-LmbN und His-tag-LmbPCP mit [3H]-4‘-Ppant
3.4.5 Beladung von His-tag-LmbN und His-tag-LmbPCP mit [3H(U)]-PPL
3.4.5.1 In vitro-Beladung des gereinigten His-tag-LmbN bzw. His-tag-LmbPCP mit [3H(U)]-PPL
3.4.5.2 In vitro Protein-Beladung mit [3H(U)]-PPL in Extrakten LmbC˚ und LmbN-produzierender E. coli
3.4.5.3 In vitro-Beladung mit [3H(U)]-PPL in Extrakten LmbC- und LmbN-produzierender S.€lividans
3.4.6 Versuche zur in vitro NDL-Synthese aus PPL und MTL
3.5 Erzeugung einer lmbN-Deletionsmutante
3.5.1 Konstruktion des Suizid-Vektors pMHW16
3.5.2 Konstruktion des Suizid-Vektors pMHW17
3.5.3 Isolierung und genetische Charakterisierung der lmbN-Deletionsmutante
3.5.4 Biochemische Charakterisierung und Komplementation der lmbN-Mutante
4 Diskussion
4.1 LmbC, die PPL-Adenylat Synthetase
4.2 LmbN/LmbPCP, eine Domänenfusion an ein Fremdprotein?
4.3 Perspektiven
5 Literaturverzeichnis