Abbau von Chlorbenzol in Pseudomonas putida GJ31 : das Plasmid pKW1 / vorgelegt von Markus Kunze. 2002
Content
Abstract
1 Einleitung
1.1 Die Umweltrelevanz anthropogener Schadstoffemissionen
1.2 Modifizierter ortho-Weg versus meta-Weg
1.3 Pseudomonas putida GJ31: Mineralisierung von 3-Chlor˜catechol über den meta-Weg
1.4 Die genetische Umgebung von cbzE
1.5 Transponierbare Elemente als Werkzeuge für neue Abbauwege
1.6 Konstruktion von Chloraromatenverwertern
1.7 Zielsetzung dieser Arbeit:
2 Materialien und Methoden
2.1 Chemikalien und Enzyme
Enzyme:
2.3.1 Medien für Escherichia coli
2.3.2 Medien für Pseudomonas putida
2.3.3 Mineralmedium
2.3.4 Antibiotika
2.6.1 Anzucht und Lagerung von Escherichia coli
2.6.2 Anzucht und Lagerung von Pseudomonas putida
2.6.3 Stammhaltung
2.11.1 Catechol-2,3-Dioxygenase, C23O (meta-Pyrocatechase)
2.11.2 2-Hydroxymuconsäuresemialdehyd-Dehydrogenase, HMSD
2.11.3 2-Hydroxymuconsäuresemialdehyd-Hydrolase, HMSH
2.11.4 4-Oxalocrotonat-Tautomerase, OI
2.11.5 4-Oxalocrotonat-Decarboxylase, OD
2.11.6 2-Oxopent-4-enoat-Hydratase, OEH
2.11.7 4-Hydroxy-2-ketovalerat-Aldolase, HOA
2.11.8 Acetaldehyd-Dehydrogenase, ADA
2.11.9 Synthese von 2-Hydroxy-6-oxohepta-2,4-dienoat
2.11.10 Synthese von Vinylpyruvat
2.11.11 Synthese von 4-Hydroxy-2-oxovalerat
2.12 Molekularbiologische Methoden
2.12.1 Replica-Plating
2.12.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli
2.12.3 Isolierung von chromosomaler DNA
2.12.4 Methoden zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Pseudomonaden
2.12.5 In vitro-Manipulation von DNA
2.12.6 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren
2.12.7 Elution von DNA aus Agarosegelen
2.12.8 Polymerasekettenreaktion (PCR)
2.12.9 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
2.12.10 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
2.12.11 Southern Blotting und DNA-DNA-Hybridisierung
2.12.12 Klonierungen
2.12.13 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA
2.12.14 Sequenzierung von DNA
2.13 Chloridbestimmung
2.14 pH-Bestimmung
2.15 Computergestützte Analyse von DNA- und Proteinsequenzen
3 Experimente und Ergebnisse
3.1 Stammunterscheidung - Etablierung eines Nachweisverfahrens zur Bestimmung der Übertragungsrichtung
3.1.1 Bildung von Hybridstämmen mit neuen Abbaueigenschaften
3.1.2 Differenzierung der Stämme über 16S rDNA
3.1.3 Differenzierung der Stämme über Polymorphismen
3.2 Isolierung des degradativen Plasmides pKW1 aus Pseudomonas putida GJ31
3.3 Der Transposonbereich um cbzE
3.3.1 Analyse des plasmidisch codierten Transposonbereiches von Pseudomonas putida GJ31
3.3.2 Analyse nichtcodierender Bereiche
Sequenz der Ribosomenbindestelle
CTTTTTCTCATCTGAGGTAATTCACATG
TCTGTTGCCAGTGTGGGGGGCCGATAATG
ATACTGTGTATTTGCACAGTATTCATG
TCAAGCGGGTTTGAAGGGGAATAAGCATG
3.4 Lokalisierung, Klonierung und Sequenzierung eines meta-Weg-Operons auf Plasmid pKW1 aus Pseudomonas putida GJ31
Sequenz der Ribosomenbindestelle
CAAGAACAAAAAAGAAGACACGACATG
AACCGACCTGGGAATTCGACTCGAATG
TAGACATTACATAGGATAATAAAAATG
Substrat
Catechol
3.5 Identifizierung, Klonierung und Sequenzierung eines peripheren Abbauweges aus Pseudomonas putida GJ31
4 Diskussion
4.1 Transposons und mögliche Transpositionsereignisse
4.2 Ein neues meta-Operon in Stamm GJ31
4.3 Vergleich der beiden Abbau-Cluster von Stamm GJ31 mit Abbauclustern anderer Stämme
4.4 CbzE(2) - eine neue Catechol-2,3-Dioxygenase in Stamm GJ31
4.5 Abbau von 3-Chlorcatechol bzw. 4-Chlorcatechol
4.6 Inaktivierung der Hydrolase durch 4-substituierte Verbindungen
4.7 Ein neuer oberer Abbauweg in Stamm GJ31
4.8 Ausblick
5 Zusammenfassung
6 Literatur
7 Abkürzungen
8 Anhang