Content

•  
   Abstract
•  
  1 Einleitung
•  
   1.1 Die Umweltrelevanz anthropogener Schadstoffemissionen
•  
   1.2 Modifizierter ortho-Weg versus meta-Weg
•  
   1.3 Pseudomonas putida GJ31: Mineralisierung von 3-Chlor˜catechol über den meta-Weg
•  
   1.4 Die genetische Umgebung von cbzE
•  
   1.5 Transponierbare Elemente als Werkzeuge für neue Abbauwege
•  
   1.6 Konstruktion von Chloraromatenverwertern
•  
   1.7 Zielsetzung dieser Arbeit:
•  
  2 Materialien und Methoden
•  
   2.1 Chemikalien und Enzyme
•  
   Enzyme:
•  
   2.3.1 Medien für Escherichia coli
•  
   2.3.2 Medien für Pseudomonas putida
•  
   2.3.3 Mineralmedium
•  
   2.3.4 Antibiotika
•  
   2.6.1 Anzucht und Lagerung von Escherichia coli
•  
   2.6.2 Anzucht und Lagerung von Pseudomonas putida
•  
   2.6.3 Stammhaltung
•  
   2.11.1 Catechol-2,3-Dioxygenase, C23O (meta-Pyrocatechase)
•  
   2.11.2 2-Hydroxymuconsäuresemialdehyd-Dehydrogenase, HMSD
•  
   2.11.3 2-Hydroxymuconsäuresemialdehyd-Hydrolase, HMSH
•  
   2.11.4 4-Oxalocrotonat-Tautomerase, OI
•  
   2.11.5 4-Oxalocrotonat-Decarboxylase, OD
•  
   2.11.6 2-Oxopent-4-enoat-Hydratase, OEH
•  
   2.11.7 4-Hydroxy-2-ketovalerat-Aldolase, HOA
•  
   2.11.8 Acetaldehyd-Dehydrogenase, ADA
•  
   2.11.9 Synthese von 2-Hydroxy-6-oxohepta-2,4-dienoat
•  
   2.11.10 Synthese von Vinylpyruvat
•  
   2.11.11 Synthese von 4-Hydroxy-2-oxovalerat
•  
  2.12 Molekularbiologische Methoden
•  
   2.12.1 Replica-Plating
•  
   2.12.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli
•  
   2.12.3 Isolierung von chromosomaler DNA
•  
   2.12.4 Methoden zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Pseudomonaden
•  
   2.12.5 In vitro-Manipulation von DNA
•  
   2.12.6 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren
•  
   2.12.7 Elution von DNA aus Agarosegelen
•  
   2.12.8 Polymerasekettenreaktion (PCR)
•  
   2.12.9 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
•  
   2.12.10 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
•  
   2.12.11 Southern Blotting und DNA-DNA-Hybridisierung
•  
   2.12.12 Klonierungen
•  
   2.12.13 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA
•  
   2.12.14 Sequenzierung von DNA
•  
   2.13 Chloridbestimmung
•  
   2.14 pH-Bestimmung
•  
   2.15 Computergestützte Analyse von DNA- und Proteinsequenzen
•  
  3 Experimente und Ergebnisse
•  
  3.1 Stammunterscheidung - Etablierung eines Nachweisverfahrens zur Bestimmung der Übertragungsrichtung
•  
   3.1.1 Bildung von Hybridstämmen mit neuen Abbaueigenschaften
•  
   3.1.2 Differenzierung der Stämme über 16S rDNA
•  
   3.1.3 Differenzierung der Stämme über Polymorphismen
•  
   3.2 Isolierung des degradativen Plasmides pKW1 aus Pseudomonas putida GJ31
•  
   3.3 Der Transposonbereich um cbzE
•  
   3.3.1 Analyse des plasmidisch codierten Transposonbereiches von Pseudomonas putida GJ31
•  
   3.3.2 Analyse nichtcodierender Bereiche
•  
   Sequenz der Ribosomenbindestelle
•  
   CTTTTTCTCATCTGAGGTAATTCACATG
•  
   TCTGTTGCCAGTGTGGGGGGCCGATAATG
•  
   ATACTGTGTATTTGCACAGTATTCATG
•  
   TCAAGCGGGTTTGAAGGGGAATAAGCATG
•  
   3.4 Lokalisierung, Klonierung und Sequenzierung eines meta-Weg-Operons auf Plasmid pKW1 aus Pseudomonas putida GJ31
•  
   3.4.1 Analyse des plasmidisch codierten meta-Weges von Pseudomonas putida GJ31
•  
   3.4.1.1 Analyse nichtcodierender Bereiche
•  
   Sequenz der Ribosomenbindestelle
•  
   CAAGAACAAAAAAGAAGACACGACATG
•  
   AACCGACCTGGGAATTCGACTCGAATG
•  
   TAGACATTACATAGGATAATAAAAATG
•  
   Substrat
•  
   Catechol
•  
   3.5 Identifizierung, Klonierung und Sequenzierung eines peripheren Abbauweges aus Pseudomonas putida GJ31
•  
   3.5.1 PCR-Strategie
•  
   3.5.2 Analyse nichtcodierender Bereiche
•  
   3.5.3 Analyse codierender Bereiche
•  
   3.5.3.1 Die Genprodukte CbzAa und CbzAb
•  
   3.5.3.2 Die Genprodukte CbzAc und CbzAd
•  
   3.5.3.3 Das Genprodukt CbzB
•  
   3.5.3.4 Das Genprodukt CbzE(3)
•  
   4 Diskussion
•  
   4.1 Transposons und mögliche Transpositionsereignisse
•  
   4.2 Ein neues meta-Operon in Stamm GJ31
•  
   4.3 Vergleich der beiden Abbau-Cluster von Stamm GJ31 mit Abbauclustern anderer Stämme
•  
   4.4 CbzE(2) - eine neue Catechol-2,3-Dioxygenase in Stamm GJ31
•  
   4.5 Abbau von 3-Chlorcatechol bzw. 4-Chlorcatechol
•  
   4.6 Inaktivierung der Hydrolase durch 4-substituierte Verbindungen
•  
   4.7 Ein neuer oberer Abbauweg in Stamm GJ31
•  
   4.8 Ausblick
•  
   5 Zusammenfassung
•  
   6 Literatur
•  
   7 Abkürzungen
•  
  8 Anhang
•  
   8.1 DNA-Sequenz des Transposonbereiches um cbzE
•  
   8.2 DNA-Sequenz des meta-Operons von Ps. putida Stamm GJ31
•  
   8.3 DNA-Sequenz des oberen Abbauweges von Ps. putida Stamm GJ31