Abbau von Chlorbenzol in Pseudomonas putida GJ31 : das Plasmid pKW1 / vorgelegt von Markus Kunze. 2002
Inhalt
- Abstract
- 1 Einleitung
- 1.1 Die Umweltrelevanz anthropogener Schadstoffemissionen
- 1.2 Modifizierter ortho-Weg versus meta-Weg
- 1.3 Pseudomonas putida GJ31: Mineralisierung von 3-Chlor˜catechol über den meta-Weg
- 1.4 Die genetische Umgebung von cbzE
- 1.5 Transponierbare Elemente als Werkzeuge für neue Abbauwege
- 1.6 Konstruktion von Chloraromatenverwertern
- 1.7 Zielsetzung dieser Arbeit:
- 2 Materialien und Methoden
- 2.1 Chemikalien und Enzyme
- Enzyme:
- 2.3.1 Medien für Escherichia coli
- 2.3.2 Medien für Pseudomonas putida
- 2.3.3 Mineralmedium
- 2.3.4 Antibiotika
- 2.6.1 Anzucht und Lagerung von Escherichia coli
- 2.6.2 Anzucht und Lagerung von Pseudomonas putida
- 2.6.3 Stammhaltung
- 2.11.1 Catechol-2,3-Dioxygenase, C23O (meta-Pyrocatechase)
- 2.11.2 2-Hydroxymuconsäuresemialdehyd-Dehydrogenase, HMSD
- 2.11.3 2-Hydroxymuconsäuresemialdehyd-Hydrolase, HMSH
- 2.11.4 4-Oxalocrotonat-Tautomerase, OI
- 2.11.5 4-Oxalocrotonat-Decarboxylase, OD
- 2.11.6 2-Oxopent-4-enoat-Hydratase, OEH
- 2.11.7 4-Hydroxy-2-ketovalerat-Aldolase, HOA
- 2.11.8 Acetaldehyd-Dehydrogenase, ADA
- 2.11.9 Synthese von 2-Hydroxy-6-oxohepta-2,4-dienoat
- 2.11.10 Synthese von Vinylpyruvat
- 2.11.11 Synthese von 4-Hydroxy-2-oxovalerat
- 2.12 Molekularbiologische Methoden
- 2.12.1 Replica-Plating
- 2.12.2 Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli
- 2.12.3 Isolierung von chromosomaler DNA
- 2.12.4 Methoden zur Isolierung von Plasmid-DNA aus Pseudomonaden
- 2.12.5 In vitro-Manipulation von DNA
- 2.12.6 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren
- 2.12.7 Elution von DNA aus Agarosegelen
- 2.12.8 Polymerasekettenreaktion (PCR)
- 2.12.9 Spaltung von DNA mit Restriktionsenzymen
- 2.12.10 Radioaktive Markierung von DNA-Fragmenten
- 2.12.11 Southern Blotting und DNA-DNA-Hybridisierung
- 2.12.12 Klonierungen
- 2.12.13 Transformation von Bakterien mit Plasmid-DNA
- 2.12.14 Sequenzierung von DNA
- 2.13 Chloridbestimmung
- 2.14 pH-Bestimmung
- 2.15 Computergestützte Analyse von DNA- und Proteinsequenzen
- 3 Experimente und Ergebnisse
- 3.1 Stammunterscheidung - Etablierung eines Nachweisverfahrens zur Bestimmung der Übertragungsrichtung
- 3.1.1 Bildung von Hybridstämmen mit neuen Abbaueigenschaften
- 3.1.2 Differenzierung der Stämme über 16S rDNA
- 3.1.3 Differenzierung der Stämme über Polymorphismen
- 3.2 Isolierung des degradativen Plasmides pKW1 aus Pseudomonas putida GJ31
- 3.3 Der Transposonbereich um cbzE
- 3.3.1 Analyse des plasmidisch codierten Transposonbereiches von Pseudomonas putida GJ31
- 3.3.2 Analyse nichtcodierender Bereiche
- Sequenz der Ribosomenbindestelle
- CTTTTTCTCATCTGAGGTAATTCACATG
- TCTGTTGCCAGTGTGGGGGGCCGATAATG
- ATACTGTGTATTTGCACAGTATTCATG
- TCAAGCGGGTTTGAAGGGGAATAAGCATG
- 3.4 Lokalisierung, Klonierung und Sequenzierung eines meta-Weg-Operons auf Plasmid pKW1 aus Pseudomonas putida GJ31
- Sequenz der Ribosomenbindestelle
- CAAGAACAAAAAAGAAGACACGACATG
- AACCGACCTGGGAATTCGACTCGAATG
- TAGACATTACATAGGATAATAAAAATG
- Substrat
- Catechol
- 3.5 Identifizierung, Klonierung und Sequenzierung eines peripheren Abbauweges aus Pseudomonas putida GJ31
- 4 Diskussion
- 4.1 Transposons und mögliche Transpositionsereignisse
- 4.2 Ein neues meta-Operon in Stamm GJ31
- 4.3 Vergleich der beiden Abbau-Cluster von Stamm GJ31 mit Abbauclustern anderer Stämme
- 4.4 CbzE(2) - eine neue Catechol-2,3-Dioxygenase in Stamm GJ31
- 4.5 Abbau von 3-Chlorcatechol bzw. 4-Chlorcatechol
- 4.6 Inaktivierung der Hydrolase durch 4-substituierte Verbindungen
- 4.7 Ein neuer oberer Abbauweg in Stamm GJ31
- 4.8 Ausblick
- 5 Zusammenfassung
- 6 Literatur
- 7 Abkürzungen
- 8 Anhang